سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش PCR پرداخته است.
PCR چیست؟
واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase chain reaction) یا PCR، در زیست شناسی مولکولی برای ایجاد تعداد زیادی رونوشت از توالی های کوتاه DNA یا ژن بکار می‌رود که ابزاری رایج در پزشکی و تحقیقات زیست‌شناسی است. با استفاده از این روش می‌توان هزاران یا میلیون ها نسخه کپی از قسمت خاصی از DNA را از مقدار کمی DNA بدست آورد.
این تکنیک در سال ۱۹۸۳ توسط یک بیوشیمیست آمریکایی به نام Kary Mullis اختراع شد که در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را برای این اختراع خود دریافت کرد.
اساس کار PCR، شامل فرآیند گرم کردن و سرد کردن است که زنجیره های دمایی نامیده شده و توسط دستگاه مربوطه فراهم می‌شود. فرآیند PCR ممکن است چند ساعت به طول بیانجامد و یا با استفاده از دستگاه‌های خاص با سرعت بالا، در کمتر از یک ساعت انجام شود. این چرخه های دمایی ابتدا بصورت دستی کنترل می‌شدند و همچنین از آنزیم پلیمرازی استفاده می شد که نسبت به دما حساس بود و در هر چرخه دمایی denature می‌شد؛ در نتیجه لازم بود در هر چرخه، دوباره آنزیم پلیمراز به محیط اضافه شود. Mullis در سال ۱۹۸۵ آنزیم Taq DNA polymerase را از باکتری حرارت دوست Thermus aquaticus استخراج و در آزمایش بکار برد تا در طول انجام PCR پایدار بوده و نیاز به اضافه کردن مجدد آنزیم در هر چرخه دمایی نباشد. همچنین در سال ۱۹۸۷ اولین ماشین PCR که PCR 1000 Thermal Cycler نام داشت توسط Cetus و Perkin-Elmer ساخته و به آزمایشگاه ها عرضه شد تا چرخه های دمایی را بطور اتوماتیک تکرار کند.
مواد لازم PCR
- DNA اولیه ای که قصد تکثیر آن را داریم.
- پرایمر ها (آغازگرها)
- نوکلئوتیدها؛ که به آن ها dNTP گفته می‌شود و واحدهای ساختاری DNA هستند.
- آنزیم Taq polymerase (برای اضافه کردن نوکلئوتید ها به زنجیره DNA)
- بافر که برای ایجاد شرایط مناسب واکنش بکار می‌رود.
مراحل PCR
۱.مرحله‌ی واسرشته شدن یا denaturing phase
مرحله ای که در آن، در نتیجه‌ی بالا رفتن دمای واکنش تا حدود ۹۴ درجه‌ی سانتیگراد، با شکستن پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازها،دو رشته DNA از هم جدا شده و از یک مولکول DNA، دو تک رشته DNA حاصل می‌شود که هر کدام از این رشته ها بعنوان رشته‌ی الگو برای ساخت DNA جدید عمل می‌کنند.این مرحله بین ۱۵ تا ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.
۲.مرحله‌ی اتصال یا annealing phase
در این فازدما تا حدود ۵۰-۶۵ درجه (بسته به دمای اتصال پرایمرها) کاهش می‌یابد تا پرایمرها به ناحیه مکمل خود در DNA متصل می‌شوند. (یکی از پرایمرها به سر ‘۵ یک رشته‌ی DNA و دیگری به سر ‘۳ رشته‌ی دیگر متصل می‌شوند). مرحله‌ی اتصال حدود ۱۰ تا ۳۰ ثانیه طول می‌کشد.
۳.مرحله‌ی گسترش یا extension phase
افزایش مجدد دما، تا حدود ۷۲ درجه سانتیگراد، سبب فراهم آمدن دمای مطلوب برای فعالیت آنزیم DNA polymerase Taq شده و آنزیم می‌تواند در چنین شرایطی dNTP ها را به پرایمر اولیه اضافه کرده و به تدریج رشته‌ی جدید را طویل سازد. این آنزیم از باکتری گرمادوستی به نام Thermus aquaticus گرفته شده که در دماهای بالا قادر به ادامه‌ی حیات است. بنا براین آنزیم در دمای بالایی که طی فاز denaturing با آن مواجه است تخریب نمی‌شود. مدت زمان این مرحله به طول DNA بستگی دارد ولی رونویسی هر هزار نوکلئوتید بطور متوسط حدود ۱ دقیقه زمان می برد.
این سه مرحله حدود ۲۰ تا ۴۰ بار در طول PCR تکرار می‌شوند و هربار مقدار DNA موجود، به دوبرابر افزایش می‌یابد.
پس از این که تکثیر انجام شد با استفاده از تکنیک الکتروفورز، کیفیت و اندازه‌ی DNA های ساخته شده قابل بررسی است.
اگر به این مبحث علاقه مندید، مقاله« Real time PCR و کاربردهای آن» را مطالعه بفرمایید.
گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی
vistagene vistagene ویستاژن