سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح اصول محلول سازی پرداخته است.

اصول محلول سازی

پیش از آشنایی با اصول محلول سازی ابتدا باید نکات ایمنی را به طور کامل رعایت کنید و وسایل مورد نیاز محلول سازی را بشناسید. از این رو برای احتیاط، به این نکات توجه کنید 

  • هنگام ورود به آزمایشگاه حتما از روپوش پزشکی، دستکش و عینک آزمایشگاهی استفاده کنید.
  • برای دور ریختن محلول هایی که آتش گیر هستند از ظرف شویی آزمایشگاه استفاده نکنید زیرا فاضلاب این ظرف شویی ها تنها برای خروج آب است.
  • توجه داشته باشید اگر حلال آب و حل شونده ی اسید دارید، هیچ وقت آب را به اسید اضافه نکنید بلکه برای مخلوط این دو، ابتدا آب را در ظرف مناسب ریخته و سپس کم کم اسید را به اندازه نیاز اضافه کنید.

وسایل مورد نیاز محلول سازی 

برای محلول سازی در جامدات و مایعات از وسایل متفاوتی استفاده می شود .

وسایل محلول سازی جامدات 

شیشه ساعت، بشر، بالن ژوژه مناسب، قاشقک، همزن شیشه ای، پیست آب مقطر

وسایل محلول سازی مایعات 

بشر، بالن ژوژه مناسب،پیپت مناسب، پیست آب مقطر، استوانه مدرج

محلول سازی در جامدات 

پیش از محول سازی جامدات ابتدا باید با تعاریف زیر آشنا باشید .

محلول: محلول ها بدین صورت تعریف می شوند: مخلوط های همگن، محلول هامعمولا براساس حالت فیزیکی  طبقه بندی می شوند که شامل محلول های جامد،مایع و گاز است.

حلال: اغلب به جزئی از یک محلول که  مقدارش بیشتر از اجزای دیگر است حلال می گویند.گرچه استفاده از این واژه اختیاری است و دقیق نیست. برای محلول های گازی، واژه ی حلال و حل شونده زیاد مورد استفاده نیست.

حل شونده: اغلب به جزئی از محلول که از اجزای دیگر کمتر است حل شونده گفته می شود.

غلظت: به مقدار ماده ی حل شده در مقدار مشخصی حلال یا محلول گفته می شود.

انحلال پذیری:  به بیشترین مقدار از یک ماده که در مقدار مشخصی حلال حل شود و سیستم پایداریتشکیل می دهد،انحلال پذیری گفته می شود.

غلظت معمولی (C) : به مقدار ماده حل شده بر حسب گرم در یک لیتر محلول غلظت معمولی گفته می شود . [g\mL]

غلظت مولی (Cм) : به تعداد مول های حل شده در یک لیتر محلول غلظت مولی یا مولار می گویند .  [Cм=n\L] [n=m\M]  , , ] مقدار ماده بر حسب گرم] , [m=جرم مولکولی [M=

غلظت مولال : به تعداد مول های حل شده در 1000 گرم محلول غلظت مولال می گویند .

نرمالیته (N) : تعداد اکی والان گرم های حل شده در یک لیتر محلول را نرمالیته می نامند .

فرمول اکی والان : E = M\n

فرمول نرمالیته :    N = Cм . n

n در این فرمول ظرفیت ماده است . ظرفیت ماده در هر ماده متفاوت است .

اگر ماده اسید باشد ، ظرفیت ماده یا همان n برابر است با تعداد  Hهایی که در واکنش شرکت می کند .

اگر باز باشد ، ظرفیت ماده تعداد OH شرکت کننده در واکنش است .

در صورتی که ماده ی مصرفی یک نمک باشد ؛

اگر واکنش اکسایش و کاهش نباشد ظرفیت ماده (n) از رابطه ی زیر بدست می آید .

تعداد فلز . ظرفیت فلز n =

اگر واکنش اکسایش و کاهش باشد ؛

تعداد الکترون های مبادله شده = ظرفیت نمک

مثال :

واکنش بدون اکسایش و کاهش  :

NaCl + H2O →   NaOH + HCl

n=1

مثال :

واکنش اکسایش و کاهش :

Mn²⁺ → MnO₄⁻

روش حل :

به تعداد اکسیژن فرآورده ، به واکنش دهنده اکسیژن اضافه کنید .

Mn²⁺ + 4H2O → MnO₄⁻

سپس معادله را موازنه کنید .

Mn²⁺+ 4H2O → MnO₄⁻ + 8H⁺

بعد از موازنه تعداد الکترون ها را در هر طرف محاسبه کنید .

سمت واکنش دهنده 2 الکترون و سمت فرآورده 7 الکترون از دست داده است .

پس در مجموع 5 الکترون مبادله شده است .                                                                 7⁺    →  2⁺

محلول سازی 

بطور مثال برای تهیه  250ml محلول 0.1 نرمال سود باید به روش زیر عمل کنید :

فرمول :

m = V . M . N \ n . P . 10

در این فرمول P  یا درصدخلوص و جرم مولکولی بر روی ظرف مربوط به ماده نوشته شده است .

ظرفیت ماده (n) در NaCl 1 است .

به اندازه 0.1 از ظرف NaCl را به کمک قاشقک بردارید و بر روی ترازو با شیشه ساعت وزن کنید تا به طور دقیق مقدار آن بدست بیاید سپس آن را از شیشه ساعت به بشر منتقل کنید و به کمک پیست آب مقطر باقی مانده ی نمک را از شیشه ساعت به داخل بشربریزید .

در مرحله ی بعد مقداری آب مقطر با پیست داخل بشر بریزید و با همزن شیشه ایی آن را انقدر هم بزنید تا کل نمک به خوبی داخل بشر حل شود .

سپس این محلول را به بالن ژوژه مناسب که در اینجا 250ml است، منتقل کنید و با پیست آب مقطر محلول را به حجم برسانید .

توجه داشته باشید که در به حجم رساندن محلول ، قسمت مقعرآب در لوله دقیقا باید روی خط  250ml بالن ژوژه  باشد .

درب بالن ژوژه را گذاشته و به خوبی تکان دهید و کمی صبر کنید محلول 250ml 0.1 نرمال سود آماده است.

محلول سازی مایعات 

فرمول محلول سازی مایعات                                                                                                 N₁V₁ = N₂V₂

تهیه محلول مایعات می تواند به دو صورت متفاوت باشد یعنی داده های  متفاوتی برای ساخت محلول داشته باشید .

به طور مثال :

تهیه 250ml  محلول  0.2 N  اسید سولفوریک از محلول 4N  ؟

یا تهیه 250ml محلول  4N اسید سولفوریک ؟

در حالت اول N₁ ( 0.2 N ) ، V₁  ( 250ml ) و N₂ ( 4N ) را در اختیار دارید و به راحتی با قرار دادن اعداد در فرمول و حل معادله V₂ بدست می آید .

در حالت دوم  برای بدست آوردن N₂ باید نرمالیته ی غلیظ ترین محلول سولفوریک اسید را در نظر بگیریم . برای بدست آوردن این نرمالیته باید از فرمول زیر استفاده کنید .

N = 10. p. d \ E

در این فرمول d ، دانسیته است که بر روی ظرف ماده نوشته شده است و E ، اکی والان گرم با فرمول [M\n]

می باشد .

حال با داشتن N₂ و قرار دادن آن در معادله مانند حالت قبل V₂ را بدست آورید .

محلول سازی 

ابتدا از استوانه مدرج حاوی محلول اسید سولفوریک  4N به اندازه ی مورد نیاز ( V₂ ) ، اسید سولفوریک بردارید . این کار را به کمک پیپت مناسب انجام دهید . استفاده از پیپت باعث می شود تا حجم دقیقی از محلول را داشته باشید . سپس محلول را از پیپت به درون بشر بریزید . توجه داشته باشید که از قبل در بشر مقداری آب مقطر به کمک پیست ریخته باشید .

در مرحله ی بعد محلول را به بالن ژوژه (250ml ) منتقل کنید و به حجم برسانید و کمی صبر کنید . محلول 250ml 0.2N اسید سولفوریک بدست آمده است .

محلول سازی نسبت درصد 

سه نوع محلول سازی نسبت درصد وجود دارد :

  • نسبت درصد وزنی وزنی W\W
  • نسبت درصد وزنی حجمی W\V
  • نسبت درصد حجمی حجمی V/V

نسبت درصد وزنی وزنی : ( W\W )

] . 100وزن محلول \   وزن جسم حل شده[

وسایل مورد نیاز :

ترازو ، بشر ، قاشقک ، همزن شیشه ای ، پیست آب مقطر ، شیشه ساعت

مثال :

برای تهیه 10  گرم محلول دو درصد NaCl وزنی وزنی باید از یک معادله نسبت تناسب استفاده کنید .

2g NaCl → 100 g

X      →  10 g

در نتیجه 0.2g  NaCl بدست می آید .

ابتدا با قاشقک از ظرف NaCl ، 0.2g  از آن را در شیشه ساعت بریزید و با ترازو وزن کنید تا مقدار دقیقی از NaCl برداشته باشید . سپس آن را به بشر منتقل کنید و با پیست آب مقطر به بشر آب اضافه کنید و و با همزن شیشه ای انقدر هم بزنید تا تمام حل شونده به طور کامل حل شود و در آخر نیز به حجم برسانید ( 10ml ) .

نسبت درصد وزنی حجمی W\V :

] . 100حجم محلول \وزن جسم حل شده[

مثال :

برای تهیه ی 100ml محلول 1 درصد NaCl وزنی حجمی باید از روش تناسب استفاده کنید .

1g NaCl → 100 ml

X  →   100 ml

1 میلی لیتر NaCl بدست می آید .

وسایل مورد نیاز این محلول سازی و روش کار آن مانند محلول سازی از جامدات است .

نسبت درصد حجمی حجمی V\V :

] . 100حجم محلول \ حجم جسم حل شده[

مثال :

برای تهیه  100ml محلول 5 درصد NaCl از محلول 20 درصد آن باید از فرمول محلول سازی مایعات استفاده کنید .

C₁V₁ = C₂V₂

با جایگذاری اعداد، V₂ بدست می آید .

در این محلول سازی محاسبه و وسایل مورد نیاز و روش کار مانند محلول سازی از مایعات است.

گردآورنده: آیدا مظفرزاده

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش استخراج DNA از خون پرداخته است.

کاربرد های استخراج DNA از خون

جهت انجام بررسی های مولکولی ، تشخیصی پزشکی ، مهندسی ژنتیک ، پزشکی قانونی استخراج DNA از سلول ها ضرورت دارد.

همچنین در تهیه ی داروهای نوترکیب یکی از روش ها استخراج DNA است. داروهایی که به این ترتیب ساخته می شوند یعنی از طریق ژنتیک نوترکیب شامل : هورمون رشد گاوی (bVh) و هورمون رشد انسان (hGh) است. علاوه بر این ها و تعدادی از هورمون های دیگر، تولید انسین نیز یکی از بیشترین ها است .

سلول های خونی تشکیل شده از گلبول های قرمز، گلبول های سفید و پلاکت ها هستند .
گلبول های قرمز در انتقال اکسیژن به سلول ها و دفع دی اکسید کربن از سلول ها نقش دارند، گلبول های سفید در ایمنی بدن نقش دارند و پلاکت ها درهنگام جراحت در لخته شدن خون با ترشح فاکتور های انعقادی نقش دارند.
اما برای استخراج DNA از خون تنها از گلبول های سفید می توان استفاده کرد. زیرا بقیه ی سلول های خونی فاقد هسته هستند و در نتیجه DNA ندارند.

برای استخراج DNA از خون پروتکل های مختلفی وجود دارد که یکی از آن ها را به صورت کلی در اینجا به عنوان نمونه معرفی می کنیم.

برای استخراج DNA از گلبول های سفید از دو روش فیزکی و شیمیایی استفاده می کنند، در روش فیزیکی کاری می کنند که منجر به شکست غشا و خارج شدن ماده ی ژنتیکی می گردد مانند انجماد، شوک گرمایی، له کردن با سانتریفیوژ و… و در روش شیمیایی از دترجنت ها و آنزیم ها برای لیز کردن غشا استفاده می کنند.

مراحل انجام استخراج DNA از خون

پس از گرفتن نمونه ی خون از فرد داوطلب آن را داخل فالکون حاوی هپارین (ضد انعقاد) ریخته و به خوبی مخلوط می کنیم.

حال باید پلاسما را از سلول های خونی جدا کنیم برای این کار خون را در ویال ریخته و سانتریفیوژ می کنیم (با سرعت 10000 rpm به مدت ۴ دقیقه ) البته ممکن است این اعداد در مقالات و پروتکل های مختلف کمی متفاوت باشد .
سپس مایع رویی را دور ریخته و سلول های ته نشین شده را حفظ می کنیم .
در مرحله ی بعدی به ویال حاوی رسوب محلول لایزیز بافر را اضافه می کنیم و با همان سرعت و همان زمان مجددا عمل سانتریفیوژ را انجام می دهیم. 
رسوب تشکیل شده حاوی هسته ی گلبول های سفید و پلاکت هاست. 
و مایع رویی که حاوی غشای تکه تکه شده ی گلبول های سفید و قرمز است را دور می ریزیم.
حال می بایست پلاکت ها را که در واقع ماهیت پروتئینی دارند از بین ببریم تا بتوانیم از هسته ی حاوی DNA جداسازی کنیم. 
برای این کار از آنزیم های تجزیه کننده ی پروتیئن استفاده می کنیم و سپس از آنزیمی استفاده می کنیم که باعث یکدستی چسبیدن پروتئین های تکه تکه از هم شود تا سنگین شوند و کف ویال با سانتریفیوژ مجدد رسوب کنند. 
حال مایع حاوی هسته را در ویال جدا گانه میریزیم و سپس به آن بافری اضافه می کنیم که باعث تخریب غشای هسته و خارج شدن DNA و RNA گردد. 
بعداز اضافه کردن بافر دوم دوباره عمل سانتریفیوژ را تکرار می کنیم و رسوب حاوی DNA و RNA را نگه میداریم.

جهت تخلیص DNA از دو مرحله استفاده می کنیم

اول به رسوب الکل ۹۹٪جهت لیز شدن پروتئین های اضافی استفاده می کنیم
و سپس مرسوب را به کاغذ صافی منتقل کرده و آنزیم RNAase را اضافه کرده تا RNA از بین رود و فقط DNA باقی بماند. DNA را با بافر TE به حالت سوسپانسیون درآورده جهت انجام آزمایشات مختلف نگهداری می کنیم.

لازم به ذکر است استفاده از کیت های استخراج DNA ساده ترین روش است زیرا این کیت ها خودشان داری پروتکل هستند.

گردآورنده : جناب آقای محمد حسین حامیانفر

سایت ویستاژن

    وسترن بلات با استفاده از Anti-His

وسـتـرن بـلاتینـگ شامل جد‌اسازی مخلوط پروتئینی بر روی ژل و سپس انتقال آن‌ها به یک غشای مناسب است. سپس مولکول پــروتـئـیـن از طـریـق میان کنش بـا یـک آنـتــی‌بــادی اخـتـصــاصــی نشان‌دار، شـنــاســایـی می‌شود. ازآنجایی‌که غالباً وسترن بلاتینگ را به کمک اتصال آنتی‌بادی‌ها مورد تجزیه‌وتحلیل قرار می‌دهند، به آن ایمونو بلاتینگ نیز گفته می‌شود. کلمه‌ی بلاتینگ به روش انتقال اشاره دارد و کلمه‌ی ایمونو به خاطر لزوم استفاده از واکنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی اختصاصی در مرحله شناسایی می‌باشد. این تکنیک توسط Towbin و همکاران در سال ۱۹۷۹ ابداع گردیده است و ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین‌ها به یک‌فاز جامد است. با این روش می‌توان اطلاعاتی در مورد خصوصیات مختلف آنتی‌ژن‌های پروتئینی شامل وجود و مقدار آنتی‌ژن، وزن مولکولی پروتئین، ایزوفرم‌ها و محصولات شکسته شده آن و کارایی روش استخراج آنتی‌ژن به دست آورد. درعین‌حال وسترن بلات اطلاعاتی در مورد اینکه چه مقدار پروتئین در سلول وجود دارد در اختیار ما قرار می‌دهد. در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی از این تکنیک به‌منظور بررسی و تأیید حضور یک آنتی‌بادی در بدن و تشخیص بیماری‌های عفونی و انگلی، بیماری‌های خود ایمنی و آلرژی استفاده می‌شود. در وسترن بلاتینگ مولکول‌های جداشده توسط ژل الکتروفورز از ژل به پالایه‌های غشایی انتقال داده می‌شوند. این موکول‌ها در سطح غشا فیلتری در همان محلی که منتقل‌شده‌اند پایدار باقی می‌مانند. در این حال به سهـولـت برای انجام واکنش با آنتی‌بادی‌های اختصاصی آمادگی دارند. غشا مورداستفاده در روش وسترن بلاتینگ معمولاً نیترو سلولز و یا پلی وینیل دی فلوراید[1] است. انتقال پروتئین از ژل به غشا توسط الکتروفورز معکوس و در طول ۳۰ دقیقه تا ۲ سـاعـت صـورت مـی‌گیـرد. ایـن کـار تـوسط دو روش مرطوب[2] و نیمه‌خشک[3] صورت می‌گیرد. در روش مرطوب ژل الکتروفورز در یک قاب در کنار غشا و در ظرفی حاوی بافر بین دو الکترود قرار می‌گیرد. اعمال جریان الکتریکی و برقراری اختلاف‌پتانسیل موجب مهاجرت یون‌ها از ژل به غشا خواهد شد. در روش نیمه‌خشک ظرف بافر با فیلترهای کاغذی آغشته به بافر جایگزین می‌شود. بعـد از تثبیـت پروتئین‌ها بر روی غشا برای حصول اطمینان از کامل بودن انتقال مـی‌تـوان از روش‌هـای رنـگ‌آمیـزی غیراختصاصی استفاده کرد. درعین‌حال آنتی‌بادی‌های اختصاصی قادر به نشان دادن استانداردها ازجمله مارکرهای وزن مولکولی روی ژل نیستند. بنابراین در کنار تشخیص با آنتی‌بادی می‌توان برای آنالیز کامل از یک روش رنگ‌آمیزی مانند Ponceau S استفاده کرد.

 

در این پژوهش بعد از مشاهده باند پروتئین LIV-1، تأیید پروتئین با استفاده از وسترن بلات با آنتی‌بادی Anti-His صورت گرفت.

پس از اتمام ران کردن ژل، ژل را از مخزن خارج کرده و ژل متراکم کننده را می‌بریم. در این پژوهش، از غشای نیترو­سلولز استفاده شد.

  • غشای نیتروسلولز را به مدت ۵ دقیقه در متانول قرار می­دهیم.
  • سپس غشا، ژل و ۲ عدد پد را در بافر انتقال ( ۱۴٫۴ گرم گلایسین و ۳٫۰۳ گرم تریس را در حجم ۸۰۰ میلی‌لیتر dH2O حل می‌کنیم و سپس ۲۰۰ میلی‌لیتر متانول به آن اضافه می­کنیم) به مدت ۱۵ دقیقه قرار می­دهیم.
  • سپس ژل و غشای نیتروسلولز را به دستگاه semidry منتقل می‌کنیم. بدین ترتیب ابتدا روی دستگاه کمی بافر انتقال می­ریزیم و بعد پد را روی دستگاه قرار داده و سپس غشا را روی آن می­گذاریم و با رول مخصوص حباب‌ها را خارج می­کنیم. ژل را دقیقاً روی کاغذ قرار می­دهیم و در نهایت پد را روی ژل قرار می­دهیم. حباب‌های حاصل را خارج می­کنیم و به مدت ۵۰ دقیقه با ولتاژ ۲۰ ولت، جریان الکتریکی را برقرار می­کنیم.

۵-       بعد از اتمام انتقال باندهای پروتئین به غشا، غشا را در بافر blocking buffer(Skim milk 3%) به مدت یک شب در ۴ درجه سانتی‌گراد قرار می­دهیم.

۶-        روز بعد غشا را با بافر PBS 1X،۴ بار شستشو می­دهیم.

۷-       سپس آنتی­بادی، آنتی His با غلظت ۱ به ۲۰۰۰ اضافه گردید و به مدت ۱۶ ساعت در دمای اتاق شیک شد.

۸-        غشا ۴ بار با بافر PBS 1X، شستشو داده شد.

  • سپس آنتی­بادی αRb HRP با غلظت ۱ به ۱۰۰۰ اضافه گردید و در دمای اتاق به مدت ۶ ساعت بر روی شیکر ،شیک شد.
  • سپس با محلول رنگ­زا DAB   رنگ­آمیزی شد.

 

[1]-PolyvinylideneDifluoride) PVDF(

[2]– Wet

[3]-Semi dry

سایت ویستاژن به توضیح روش استخراج DNA از باکتری و پروتکل آن پرداخته است.

به طور کلی باکتری ها به  دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می شوند. این تقسیم بندی به دلیل تفاوت در ساختار دیواره سلولی و نوع رنگ پذیری آنها صورت گرفته است. باکتری های گرم مثبت دارای لایه ضخیمی از پپتید و گلیکان در دیواره سلولی خود هستند ولی باکتری های گرم منفی لایه نازکی از پپتید و گلیکان در دیواره سلولی خود دارند لذا مقاومت کمتری نسبت به گرم مثبت ها دارند.

بررسی ژنتیکی باکتری ها نشان داده آنها هاپلوید بوده و تنها یک نسخه DNA حلقوی دارند.

اصول استخراج DNA در تمام سویه ها یکسان است که شامل تخریب غشا، رسوب مرحله ای ناخالصی ها و نهایتا استخراج DNA خالص است.

دو روش برای استخراج DNA وجود دارد

  1. روش فیزیکی: شامل استفاده از حرارت،انجماد، فشار اسمزی و …..
  2. روش شیمیایی: شامل استفاده از آنزیم ها، دترجنت ها و بافرهای خاص می باشد.
  3. در استخراج DNA از باکتری ها باید از روشی استفاده کنیم که کمترین آسیب به DNA که فاقد غشا هسته است وارد شود.

روش فیزیکی:

مزیت این روش ارزان تر بودن آن است و همچنین ریسک آسیب به DNA را نسبت به روش شیمیایی با استفاده از آنزیم ها کمتر می کند.

مواد و لوازم مورد نیاز

سوسپانسیون باکتریایی

بافرTBE

بافر TE

آّب

سانتریفیوژ

بن ماری

سمپلر

ویال

کاغذ صافی

روش انجام آزمایش

ابتدا به وسیله سمپلر 500 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری را در ویال ریخته و به مدت 5 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفیوژ می کنیم. رسوب بدست آمده حاوی باکتری های زنده است و فاز مایع رویی حاوی باکتری های مرده که دور ریخته می شود.

در مرحله بعد 300 میکرولیتر بافر TBE به رسوب موجود در ویال افزوده و به مدت 5 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ می شود. بافر TBE باعث تغییر PH در اطراف محیط DNA می شود و همین تغییر PH باعث فشرده تر شدن DNA می شود. این فشردگی DNA باعث می شود تا در اثر سانتریفیوژ آسیب نبیند. رسوب حاصل که بر اثر دریافت بافر سنگین و ته نشین شده را نگه می داریم و فاز مایع که حاوی باکتری های زنده فاقد بافر است را دور می ریزیم.

میزان 400 میکرولیر آب را در ویال ریخته و به مدت 20 دقیقه در بن ماری 80 درجه قرار می دهیم. استفاده از آب سبب پخش گرما به طور یکنواخت به تمام قسمت های ویال می شود.

سپس ویال را به مدت 3 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ میکنیم. رسوب حاویDNA  و RNA و پروتیین ها را نگه داشته و فاز مایع رویی حاوی غشا خارجی سیتوپلاسم  و اندامک ها را دور می ریزیم.

تا اینجا به دلیل استفاده زیاد از سانتریفیوژ و بن ماری غشا خارجی باکتری ها شکنده و ضعیف شده است و از طرفی برخورد باکتری ها به یکدیگر و فشار محتویات سیتوپلاسم به دیواره در طی سانتریفیوژ منجر به لیز دیواره و آزاد شدن DNA در محیط می شود. یعنی عملا از هیچگونه آنزیمی برای لیز دیواره استفاده نکردیم.

در مرحله آخر جهت تخلیص DNA و RNA و پروتیین ها، رسوب را به ویال فیلتردار منتقل می کنیم. ویال فیلتر دار دارای بار مثبت است و DNA چون بار منفی دارد، به ویال می چسبد و اتصالی قوی با آن پیدا میکند. برای لیز RNA و پروتیین های موجود در ویال فیلتر دار، می توان از آنزیم RNAase و پروتیاز استفاده کنیم. سپس با استفاده از بافر TE،می توان DNA تخلیص شده را به صورت سوسپانسیون درآورد و برای عمل PCR  و کارهای تحقیقاتی بعدی خفظ کرد.

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش SDS PAGE پرداخته است.

 

یکی از روش‌های بررسی بیان پروتئین، استفاده از روش الکتروفورز پروتئین می‌باشد. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید جهت تعیین وزن مولکول پروتئین‌ها، روشی رایج و مهم در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی می‌باشد. این روش ضمن ساده بودن به مقدار کمی نمونه برای انجام آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تفکیک مناسب برای شناسایی و تعیین خلوص پروتئین‌هاست. در این مقاله به توضیح الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE (الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات) پرداخته شده است. ژل SDS-PAGE در یک الکتروفورز، در دو قسمت ژل جداکننده[1] و متراکم کننده[2] اجرا می‌شود. ژل متراکم کننده با آکریل آمید 5% در بالای ژل جداکننده (پس از انجماد) قرار می‌گیرد و شانه در ژل متراکم کننده قرار می‌گیرد.

SDS PAGE

جدول 1) درصد آکریل آماید مورداستفاده نسبت به وزن مولکولی پروتئین

محدوده وزن مولکولی درصد آکریل آماید
50 kDa – 500 kDa 7%
20 kDa – 300 kDa 10%
10 kDa – 200 kDa 12%
3 kDa – 100 kDa 15%
  • درصد آکریل آماید ژل به سایز نمونه پروتئین بستگی دارد (جزئیات در جدول 1 نشان داده‌شده است)
  • حجم ژل متراکم کننده و جدا کننده برحسب ضخامت کاست متفاوت است (جدول 2).

جدول 2 حجم ژل متراکم کننده و جداکننده برحسب ضخامت کاست

 

 

حجم ژل متراکم کننده ضخامت ژل
4ml 2ml 0.75mm
6ml 3ml 1.0mm
8ml 4ml 1.5mm
  • برای تهیه ml ۵ ژل متراکم کننده مقادیر به شرح جدول 3 می‌باشد.

جدول 3) مقادیر لازم برای تهیه ۵ میلی‌لیتر ژل متراکم کننده

2.975 ml H2O
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml
10% (w/v) SDS 0.05 ml
Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 0.67 ml
10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 0.05 ml
                                                                                          TEMED 0.005 ml

SDS PAGE

 

  • برای تهیه ml۱۰ ژل جداکننده مقادیر به شرح جدول 4 می‌باشد.

جدول 4) مقادیر لازم برای تهیه ۱۰ میلی‌لیتر ژل جداکننده با درصدهای متفاوت از آکریل آماید

درصد آکریل آماید 6% 8% 10% 12% 15%
                H2O 5.2ml 4.6ml 3.8ml 3.2ml 2.2ml
Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 2ml 2.6ml 3.4ml 4ml 5ml
1.5M Tris(pH=8.8) 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml
10% (w/v)SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl
  • AP و TEMED قبل از شروع کار و آخرین ترکیباتی هستند که باید اضافه شوند.

[1]-Separating gel or Resolving gel

[2]-Stacking gel

 

SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE ویستا ژن ویستا ژن ویستاژن SDS PAGE VISTAGENE VISTAGENE

سایت ویساژن در این مقاله به توضیح روش کلونینگ پرداخته است. در صورت داشتن سوال پیرامون این روش، آن را در سایت ثبت نموده تا توسط کارشناسان ما پاسخ داده شود.

کلونینگ چیست؟

کلونینگ به تولید کپی های یکسان از ارگانیسم ها، سلول ها یا توالی های نوکلئویک اسید می گویند. این فرایند با دستکاری و تداخل انسان صورت می پذیرد.

نکته: توالی های  DNA انسانی که در طی رشد طبیعی تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب نمی شوند ولی توالی هایی که به وسیله ی  PCR  تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب می شوند.

 

کلونینگ

مراحل Gene cloning

1 – جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از بقیه قطعات DNA

2 – گزینش وکتور مناسب

3 – اینتگره و متصل کردن ژن با وکتور و ایجاد پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – منتقل کردن پلاسمید به میزبان  ( Transformation or Translection)

5 – تکثیر و زیاد کردن پلاسمید (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 – انجام رونویسی (Transcription  )

7 – ترجمه و ساخت  پروتئین (Translation )

خلاصه مراحل کار

برای کلون کردن محصول PCR که درون وکتور مناسب قرار گرفته است، به همراه وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر یکسان برش داده می شود و با یکدیگر مخلوط می گردند و توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل می شوند. در مرحله بعد این مولکول DNA نوترکیب طی روندی به نام ترانسفورماسیون به درون سلول میزبان انتقال می یابد.

جداسازی محصول PCR

در ژل آگارز قطعات DNA بر اساس وزن از هم جدا می شوند. در نتیجه باند محصول PCR از ژل جدا و خالص می شود.

مواد مورد استفاده

  • ایزوپروپانل
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer

روش کار جداسازی ژن

  • باند مورد نظر توسط اسکالپل از ژل جدا می شود. بهتر است تا حد ممکن کمترین میزان ژل به همراه باند جدا شود.
  • سپس 300 میکرو لیتر Binding Buffer  به آن اضافه می شود.
  • ژل آگارز به همراه بافر برای مدت 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار می گیرد تا ژل به خوبی حل شود.
  • 150 میکرولیتر ایزوپروپانول به آن اضافه می شود.
  • نمونه به خوبی ورتکس شده، کل نمونه به یک Filter tube که درون یک Collection tube  قرار دارد منتقل می شود. و در 13200 rpm  برای یک دقیقه سانتریوفیوژ می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 500 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 200 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • Filter tube درون یک تیوپ اپندروف استریل قرار گرفته و µl 50 محلول Elution   به آن اضافه می شود. پس از سانتریوفوژ نمونه در 13200 rpm  برای مدت 1 دقیقه  درون تیوپ انتقال می یابد.
  • برای ارزیابی کیفیت و غلظت DNA تخلیص شده 5 µl از نمونه در ژل آگارز 1 درصد ران می شود.

لایگیشن

  • لایگیشن مقدمه ای برای مرحله بعد یعنی ترانسفورماسیون می باشد جهت تکثیر قطعه هدف به مقدار زیاد، این قطعه باید در وکتور مناسب وارد شده و سپس همراه با وکتور وارد یک سلول میزبان شود.
  • آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین دو نوکلئوتید مجاور می شود. از نکات بسیار مهم در این واکنش غلظت نمونه DNA  هدف می باشد که برای موفقیت واکنش بسیار مهم است.

مواد مورد استفاده

  • پلاسمید  3 µl
  • DNA تخلیص شده 16 µl
  • Ligation buffer 3 µl
  • آنزیم 1 µl
  • PEG 3 µl
  • آب مقطر 1 µl

روش کار

  • در یک تیوپ اپندروف cc5 مواد زیر با یکدیگر مخلوط شده و سپس برای مدت یک شب در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

تهیه سلول مستعد جهت ترانسفورماسیون

  • جهت انجام ترانسفورماسیون سلول مستعد مورد نیاز است که پلاسمید نوترکیب به درون آن انتقال یابد.

مواد مورد استفاده

  • باکتری
  • محلول CaCl2
  • محلول CaCl2-MgCl2
  • DMSO
  • محیط کشت

روش کار

  • ابتدا باکتری را در محیط  کشت داده و در انکوباتور 37 ساعت انکوبه می شود.
  • یک کلونی از باکتری را در 100 میلی لیتر محیط مایع کشت داده و در شیکرانکوباتور انکوبه کرده و پس از رسیدن به فاز لگاریتمی رشد انکوباسیون متوقف گردید.
  • محیط کشت به لوله 50 میلی لیتری انتقال می یابد( این لوله قبلا درون یخ قرار گرفته) و برای مدت 10 دقیقه درون یخ قرار می گیرد.
  • سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجهء سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

محیط روی سلول ها خارج و به رسوب حاصل , 30 میلی لیتر محلول CaCl2-MgCl2 سرد استریل اضافه شد.

سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

به رسوب باکتری 2 میلی لیتر محلول صفر درجه CaCl2 اضافه شد و سوسپانسیون سلولی تهیه شد.

به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد و به آرامی مخلوط گشت. و سپس به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد.

مجددا به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه و سلول ها تقسیم و در 70- درجهء سانتیگراد نگهداری شد.

ترانسفورماسیون

  • با استفاده از روش شوک حرارتی در لحظات کوتاهی منافذی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان ایجاد کرده تا DNA نوترکیب وارد سلول شود. DNA حاصل از مرحله لایگیشن  جهت ترانسفورماسیون در سلول های مستعد مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین 100 µg/ml
  • IPTG
  • X-Gal
  • محصول لایگیشن ( پلاسمید نوترکیب)
  • سلول مستعد

روش کار

  • سلول های مستعد از دمای 70- درجه سانتیگراد خارج و در مجاورت یخ قرار داده می شوند تا به آرامی ذوب شوند.
  • تیوپ های اپندروف قبل از استفاده در یخ قرار می گیرند و سپس 20 میکرولیتر از سلول های مستعد به آنها اضافه شد.
  • 1 میکرولیتر از محصول لایگیشن به آرامی با سلول ها مخلوط و به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شد.
  • تیوپ های اپندروف حاوی سلول و پلاسمید جهت شوک حرارتی , به مدت 30 ثانیه در دمای 42 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • تیوپ های اپندروف برای مدت 2 دقیقه در یخ قرار داده شد.
  • 80 میکرولیتر محیط کشت مایع بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
  • سپس این باکتری ها روی پلیت های حاوی آمپی سیلن( 100, X-Gal و IPTG کشت داده شد و در دمای 37 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • در ترانسفورماسیون سلول ها , استفاده از کنترل جهت ارزیابی کارایی ترانسفورماسیون و سلول ها و ممانعت از آلودگی , ضروری است

غربالگری

  • برای غربال نمودن کلنی های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده از آنتی بیوتیکی که ژن مقاومت به آن توسط وکتور نوترکیب حمل می گردد استفاده می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین
  • IPTG
  • X-Gal
  • پلیت های حاوی باکتری ترانسفورم شده

روش کار

  • ابتدا پلیت حاوی محیط کشت را به مدت 20 دقیقه زیر هود قرار داده تا به دمای محیط برسد. ( به این محیط کشت قبلا آمپی سیلین اضافه شده است) .
  • 40 میکرولیتر IPTG و 40 میکرولیتر X-Gal به سطح محیط کشت اضافه کرده و با غلطک شیشه ای پخش می شود و کمی فرصت داده می شود تا این مواد جذب محیط کشت شود.
  • با یک لوپ استریل از کلنی های سفید که به صورت تک می باشد برداشته و روی پلیت جدید کشت داده می شود. این کار برای اطمینان یافتن از صحت ترانسفورماسیون در کلنی های مورد نظر می باشد.
  • سپس پلیت ها به مدت یک شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند.
  • IPTG شناسایی پروموتور ویژه ژن Lac Z در فرادست ناحیه 5´ ژن و القاء رونویسی آن و تولید آنزیم بتا گالاکتوزیداز را بر عهده دارد. سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و آنزیم بتا گالاکتوزیداز را تولید کنند حاوی وکتور نرمال می باشند. اما سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و به دلیل وارد شدن قطعه DNA هدف این ژن قادر نباشند آنزیم فوق را تولید کنند حاوی وکتور نوترکیب می باشند.
  • X-GaL به عنوان سوبسترا برای بتا گالاکتوزیداز محسوب شده و بعد از تجزیه توسط این آنزیم ماده ای به رنگ آبی تیره در اطراف سلول های حاوی ژن فعال بر جای می ماند.وکتور نوترکیب به دلیل عدم آنزیم فوق نمی تواند X-Gal را تجزیه نماید در نتیجه کلنی های تشکیل شده سفید می باشند.

استخراج پلاسمید

روش لیز قلیایی به همراه دترجنت SDS بیش از 20 سال است که برای جداسازی پلاسمید از باکتری E.Coli  مورد استفاده قرار می گیرد. اگر سوسپانسیون باکتریایی با دترجنت های غیر یونی قوی در  pH بالا مجاور شود. دیواره باکتری تخریب کروموزوم و پروتئین های باکتریایی دناتوره و پلاسمید در محیط آزاد می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط LB Broth حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین
  • Suspension Buffer
  • RNase A
  • Lysis Buffer
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer
  • High pure filter tubes
  • Collection tube

روش کار

  • باکتری در محیط حاوی آمپی سیلین کشت داده می شود تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر به 5/1 تا 5 برسد.
  • 4-5/0 میلی لیتر از محیط سانتریوفوژ می شود تا سلول ها جدا شوند.
  • سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از محلول susprnsion buffer RNase تهیه می شود.
  • 250 میکرولیتر Lysis Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.
  • 350 میکرولیتر Binding Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در روی یخ انکوبه می شود
  • نمونه به مدت 10 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • محلول رویی به درون یک فیلتر تیوپ منتقل شده و 30 ثانیه تا 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • فیلتر توسط 700 میکرولیتر Wash Buffer شسته و فیلتر تیوپ به مدت 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • مایع تجمع یافته خارج شده , و 50 میکرولیتر Elution Buffer  یا   آب به آن اضافه می شود.
  • نمونه به مدت 1 دقیقه در 13200 rpm ساتریوفوژ شده و محصول انتهایی DNA پلاسمیدی تخلیص شده می باشد.

 

vistagene   vistagene   vistsgene   vistagene  vistagene   ویستاژن ویستاژن ویستا ژن  ویستا ژن  ویستا ژن

استفاده از مطالب سایت ویستاژن تنها با ذکر نام و لینک سایت و با هماهنگی با مدیریت  امکان پذیر می باشد.