سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح آنزم های محدود کننده پرداخته است. برگرفته شده از کتاب کلون سازی ژن های پروفسور براون.

آنزیم محدود کننده

پس از نمونه های خالص DNA گام بعدی در کلون سازی ژن ساختن مولکول DNA نوترکیب است برای تولید این مولکول نوترکیب باید حامل DNA کلون سازی در محل های خاصی بریده و با روش کنترل شده ای به هم وصل شوند برش و اتصال دو نمونه از روش های دستکاری DNA است .تقریبا تمام روش های دستکاری DNA با استفاده از آنزیم های خالص انجام می شوند . این آنزیم ها درون سلول در فرآیند های اساسی مانند همانندسازی و رونویسی DNA، شکستن DNA، ترمیم DNA جهش یافته و انجام نوترکیبی بین مولکول های DNA متفاوت عمل می کنند پس از خالص کردن آن ها از عصاره سلولی بسیاری از این آنزیم ها را می توان وادار کرد که واکنش های طبیعی خود یا مشابه آن را در شرایط آزمایشگاهی انجام دهند. اگرچه غالب این واکنش های آنزیمی واکنش های ساده ای  هستند ولی بیشتر آن ها با روش های معمول قابل انجام نیستند ،بنابراین آنزیم های خالص در مهندسی ژنتیک بسیار مهم هستند و صنعت بزرگی برای تهیه ، تعیین خصوصیات و فروش آن ها به وجود آمده است تولیدکنندگان تجاری آنزیم های با خلوص بالا ، خدمت مهمی به زیست شناسان مولکولی ارائه می دهند . مهندسی ژنتیک یکی از اهداف مهم تولید ژن یا فراورده آن به صورت انبوه است . به این منظور آن ها ژن را از جاندار جدا کرده و در یک جاندار ساده مانند باکتری تکثیر می دهند . برای جداکردن ژن اولیه از سلول باید از یک آنزیم برای برش آن استفاده کنیم . این آنزیم ، آنزیم محدود کننده نام دارد . آنزیم محدودکننده یا اندونوکلئاز مختص به پروکاریوت ها است . و بصورت یک عملکرد دفاعی دربرابر عوامل خارجی عمل می کند . این آنزیم ها به صورت اختصاصی عمل می کنند و هریک ناحیه ای خاص در DNA را شناسایی می کند و برش می دهند . این آنزیم ها به 4 گروه تقسیم می شوند. نوع ساختار ، جایگاه شناسایی ، چگونگی برش ویژگی هایی است که این 4 دسته را از هم متمایز می کند .

نوکلئاز ها : نوکلئازها با شکستن پیوند های فسفودی استر متصل کننده نوکلئوتید ها در رشته DNA،باعث تجزیه DNAمی شوند ، دو نوع مختلف نوکلئاز وجود دارد :

 اگزونوکلئاز : نوکلئوتید ها را یک به یک از انتهای مولکول DNAجدا می نمایند .

اندونوکلئاز : قادر به شکستن پیوند های فسفودی استر داخلی مولکول DNA هستند .  

تفاوت اصلی بین اگزونوکلئاز های مختلف ، تعداد رشته هایی است که هنگام عمل بر مولکول دو رشته ای ، تجزیه می کنند برای گروه بندی اندونوکلئاز از معیار یکسانی استفاده می شود . اندونوکلئاز S1 فقط تک رشته ای ها را می شکند . درحالی که آنزیم دئوکسی ریبوکلئاز 1که از پانکراس گاو استخراج می شود ، هر دو نوع مولکول دو رشته ای و تک رشته ای را برش می دهد . آنزیم DNase1 غیراختصاصی است ،چون می تواند DNAرا در هر یک از پیوند های فسفودی استر درونی مورد حمله قرار دهد و نتیجه اثر طولانی مدت آن برDNA، مخلوطی از مونوکلئوتید ها و الیگونوکلئوتیدی بسیار است . از طرف دیگر گروه خاصی از آنزیم ها که اندونوکلئاز های محدودگر نامیده می شوند ، DNA دو رشته ای را در تعداد محدودی جایگاه شناسایی ویژه می شکنند .

کشف و عملکرد اندونوکلئاز های محدودگر

مشاهده اولیه ای  که در نهایت منجر به کشف اندونوکلئاز های محدودگر شد، در اوایل دهه 1950 صورت گرفت . در این بررسی نشان داده شد که بعضی از سویه های باکتری ها در مقابل آلودگی به فاژها مصونیت دارند ، پدیده ای که محدودیت تنظیم شونده توسط میزبان نامیده می شود . مکانیسم این محدودیت خیلی پیچیده نیست ، اگرچه فهم کامل آن بیش از 20 سال طول کشید . محدودیت بدین دلیل اتفاق که باکتری داری آنزیمی است که DNA فاژ ، قبل از این که فرصتی را برای همانندسازی و هدایت ساخت  ذرات فاژ جدید بدست بیاورد ، تخریب می کند . تجزیه DNAخود باکتری کشنده است ، ولی به علت داشتن گروه های متیل اضافی که عمل آنزیم های تجزیه کننده را مهار می کنند ، در مقابل آنزیم محافظت می شود . این آنزیم های تجزیه کننده اندونوکلئاز های محدودگر نامیده می شوند و توسط بسیاری و شاید تمام گونه های باکتری ساخته می شوند و تاکنون بیش از 2500 نوع مختلف از آن ها جداسازی شده و بیش از 300 نوع از آن ها برای استفاده در آزمایشگاه در دسترس است . سه دسته مختلف از آنزیم های محدودگر مشخص شده اند که هر کدام با تفاوت جزیی در عملکردشان قابل تشخیص هستند . نوع 1و3 بسیار پیچیده هستند و نقش محدودی در مهندسی ژنتیک دارند . از طرف دیگر نوع 2 اندونوکلئاز های محدودگر ، آنزیم های برشی هستند که در کلون سازی ژن بسیار اهمیت دارند.

اندونوکئاز ها ی محدودگر نوع 2 DNAرا در توالی خاصی برش می دهند : ویژگی اصلی اندونوکلئاز های محدودگر نوع 2 این است که دارای یک توالی شناسایی خاص هستند و مولکول DNAرا در آن توالی برش می دهند . یک آنزیم خاص ، DNAرا در توالی شناسایی ونه در هیچ جای دیگر برش می دهد. برای مثال ، آنزیم اندونوکلئاز محدودگری با نام Pvu1،DNA را فقط در محل نوکلئوتید شش تایی CGATCG می برد . در مقابل ، آنزیم دیگری از همین باکتری به نام Pvu2در محل یک شش تایی CAGCTG برش را انجام می دهد 

گردآورنده: سرکار خانم آیدا مظفرزاده

کاربردهای کلونینگ ژن ها در پزشکی

یکی از مهم ترین فواید انقلاب DNA نوترکیب، جنبه های بالینی آن بوده و خواهد بود. در این مقاله سایت ویستاژن به بررسی این کاربردها پرداخته است.

 

  1. تولید داروهای نوترکیب

  • انسولین نوترکیب
  • سنتز هورمون رشد انسانی در E.coli
  • فاکتور VIII نوترکیب
  • ساخت دیگر پروتئین های انسانی نوترکیب
  • واکسن های نوترکیبپ

2. تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

3. ژن درمانی

تولید داروهای نوترکیب

برخی از بیماری های انسان به دلیل فقدان پروتئین ها یا عملکرد نامناسب آن ها در بدن بوجود می آیند. بسیاری از این بیماری ها ر می توان با تجویز پروتئین مناسب درمان کرد. اما برای این کار در مرحله اول پروتئین مورد نظر باید در مقدیر بالا وجود داشته باشد. اگر پروتئین مورد نظر انسانی باشد،بدست آوردن مقادیر مناسب مشکل بزرگی محسوب می شود مگر اینکه بتوان آن را از خون استخراج کرد.

پروتئین های جیوانی اگر کارایی لازم را برای درمان بیماری های انسانی داشته باشند،مورد استفاد قرار می گیرند.اما بیماری هایی که قابل درمان با پروتئین هی حیوانی باشند،زیاد نیستند و در اغلب موارد احتمال پیدایش عوارضی مثل پاسخ خای حساسیتی وجود دارد.

 تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

دومین زمینه اصلی کاربرد کلون سازی ژن ها در تحقیقات پزشکی،شناسایی و جداسازی ژن های مسئول بیماری های انسانی است.

یک بیماری ژنتیکی یا ارثی بیماری است که در اثر نقص یک ژن خاص ایجاد می شود.افرادی که حامل ژن معیوب هستند در مرحله ای از طول حیات خود بیماری را تجربه می کنند. در مورد برخی از بیماری های ارثی مثل هموفیلی، ژن روی کروموزوم X قرار داد، بنابراین تمام مردانی که ژن معیوب دارند،بیماری را بروز می دهند و زنانی که یک ژن معیوب و یک سالم دارند،سالم خواهند ماند.اما ممکن است بیماری را به پسران خود انقال دهند.

ژن های بیماری های دیگر روی کروموزوم اتوزومی قرار دارند و در بیشتر موارد مغلوب هستند،بنابراین وجود نقص در هر کروموزوم، لازمه بروز بیماری است.تعدا کمی از بیماری ها مثل هانتینگتون، با وجودی که توزومی هستند، غالب می باشند و حتی وجود یک نسخه از ژن معیوب برای ایجاد بیماری کافی است.

اهمیت شناسایی ژن مسئول در بروز بیماری های ژنتیکی

  • با شناسی ژن ممکن است اساس بیوشیمیایی بیماری حاصل شود و به این ترتیب امکان طرای روش درمان پدید آید.
  • از شناسایی جهش های موجود در ژن معیوب می توان برای انجام برنامه های غربالگری استفاده کرد و به این ترتیب افراد حامل یا کسانی که هنوز بیماری در آنها پیشرفت نکرده است را شناسایی کرد.
  • شناسایی ژن، یک پیش نیاز برای ژن درمامی است.

ژن درمانی

ژن درمانی به روشی اطلاق می شود ک هدف آن درمان یک بیماری ارثی با انتقال نسخه صحیحی از ژن معیوب به فرد بیمار است. ژن درمانی در حال حاضر گسترش زیادی پیدا کرده است و  شامل تلاش هایی است که برای درمان بیماری، یک ژن کلون شده را به بیمار وارد می کنند.

رفرنس:کتاب کلون سازی ژن ها نوشته پروفسور براون

vistagene  vistagene   vistagene    vistagene کلویننگ 

سایت ویساژن در این مقاله به توضیح روش کلونینگ پرداخته است. در صورت داشتن سوال پیرامون این روش، آن را در سایت ثبت نموده تا توسط کارشناسان ما پاسخ داده شود.

کلونینگ چیست؟

کلونینگ به تولید کپی های یکسان از ارگانیسم ها، سلول ها یا توالی های نوکلئویک اسید می گویند. این فرایند با دستکاری و تداخل انسان صورت می پذیرد.

نکته: توالی های  DNA انسانی که در طی رشد طبیعی تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب نمی شوند ولی توالی هایی که به وسیله ی  PCR  تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب می شوند.

 

کلونینگ

مراحل Gene cloning

1 – جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از بقیه قطعات DNA

2 – گزینش وکتور مناسب

3 – اینتگره و متصل کردن ژن با وکتور و ایجاد پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – منتقل کردن پلاسمید به میزبان  ( Transformation or Translection)

5 – تکثیر و زیاد کردن پلاسمید (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 – انجام رونویسی (Transcription  )

7 – ترجمه و ساخت  پروتئین (Translation )

خلاصه مراحل کار

برای کلون کردن محصول PCR که درون وکتور مناسب قرار گرفته است، به همراه وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر یکسان برش داده می شود و با یکدیگر مخلوط می گردند و توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل می شوند. در مرحله بعد این مولکول DNA نوترکیب طی روندی به نام ترانسفورماسیون به درون سلول میزبان انتقال می یابد.

جداسازی محصول PCR

در ژل آگارز قطعات DNA بر اساس وزن از هم جدا می شوند. در نتیجه باند محصول PCR از ژل جدا و خالص می شود.

مواد مورد استفاده

  • ایزوپروپانل
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer

روش کار جداسازی ژن

  • باند مورد نظر توسط اسکالپل از ژل جدا می شود. بهتر است تا حد ممکن کمترین میزان ژل به همراه باند جدا شود.
  • سپس 300 میکرو لیتر Binding Buffer  به آن اضافه می شود.
  • ژل آگارز به همراه بافر برای مدت 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار می گیرد تا ژل به خوبی حل شود.
  • 150 میکرولیتر ایزوپروپانول به آن اضافه می شود.
  • نمونه به خوبی ورتکس شده، کل نمونه به یک Filter tube که درون یک Collection tube  قرار دارد منتقل می شود. و در 13200 rpm  برای یک دقیقه سانتریوفیوژ می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 500 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 200 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • Filter tube درون یک تیوپ اپندروف استریل قرار گرفته و µl 50 محلول Elution   به آن اضافه می شود. پس از سانتریوفوژ نمونه در 13200 rpm  برای مدت 1 دقیقه  درون تیوپ انتقال می یابد.
  • برای ارزیابی کیفیت و غلظت DNA تخلیص شده 5 µl از نمونه در ژل آگارز 1 درصد ران می شود.

لایگیشن

  • لایگیشن مقدمه ای برای مرحله بعد یعنی ترانسفورماسیون می باشد جهت تکثیر قطعه هدف به مقدار زیاد، این قطعه باید در وکتور مناسب وارد شده و سپس همراه با وکتور وارد یک سلول میزبان شود.
  • آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین دو نوکلئوتید مجاور می شود. از نکات بسیار مهم در این واکنش غلظت نمونه DNA  هدف می باشد که برای موفقیت واکنش بسیار مهم است.

مواد مورد استفاده

  • پلاسمید  3 µl
  • DNA تخلیص شده 16 µl
  • Ligation buffer 3 µl
  • آنزیم 1 µl
  • PEG 3 µl
  • آب مقطر 1 µl

روش کار

  • در یک تیوپ اپندروف cc5 مواد زیر با یکدیگر مخلوط شده و سپس برای مدت یک شب در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

تهیه سلول مستعد جهت ترانسفورماسیون

  • جهت انجام ترانسفورماسیون سلول مستعد مورد نیاز است که پلاسمید نوترکیب به درون آن انتقال یابد.

مواد مورد استفاده

  • باکتری
  • محلول CaCl2
  • محلول CaCl2-MgCl2
  • DMSO
  • محیط کشت

روش کار

  • ابتدا باکتری را در محیط  کشت داده و در انکوباتور 37 ساعت انکوبه می شود.
  • یک کلونی از باکتری را در 100 میلی لیتر محیط مایع کشت داده و در شیکرانکوباتور انکوبه کرده و پس از رسیدن به فاز لگاریتمی رشد انکوباسیون متوقف گردید.
  • محیط کشت به لوله 50 میلی لیتری انتقال می یابد( این لوله قبلا درون یخ قرار گرفته) و برای مدت 10 دقیقه درون یخ قرار می گیرد.
  • سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجهء سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

محیط روی سلول ها خارج و به رسوب حاصل , 30 میلی لیتر محلول CaCl2-MgCl2 سرد استریل اضافه شد.

سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

به رسوب باکتری 2 میلی لیتر محلول صفر درجه CaCl2 اضافه شد و سوسپانسیون سلولی تهیه شد.

به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد و به آرامی مخلوط گشت. و سپس به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد.

مجددا به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه و سلول ها تقسیم و در 70- درجهء سانتیگراد نگهداری شد.

ترانسفورماسیون

  • با استفاده از روش شوک حرارتی در لحظات کوتاهی منافذی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان ایجاد کرده تا DNA نوترکیب وارد سلول شود. DNA حاصل از مرحله لایگیشن  جهت ترانسفورماسیون در سلول های مستعد مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین 100 µg/ml
  • IPTG
  • X-Gal
  • محصول لایگیشن ( پلاسمید نوترکیب)
  • سلول مستعد

روش کار

  • سلول های مستعد از دمای 70- درجه سانتیگراد خارج و در مجاورت یخ قرار داده می شوند تا به آرامی ذوب شوند.
  • تیوپ های اپندروف قبل از استفاده در یخ قرار می گیرند و سپس 20 میکرولیتر از سلول های مستعد به آنها اضافه شد.
  • 1 میکرولیتر از محصول لایگیشن به آرامی با سلول ها مخلوط و به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شد.
  • تیوپ های اپندروف حاوی سلول و پلاسمید جهت شوک حرارتی , به مدت 30 ثانیه در دمای 42 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • تیوپ های اپندروف برای مدت 2 دقیقه در یخ قرار داده شد.
  • 80 میکرولیتر محیط کشت مایع بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
  • سپس این باکتری ها روی پلیت های حاوی آمپی سیلن( 100, X-Gal و IPTG کشت داده شد و در دمای 37 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • در ترانسفورماسیون سلول ها , استفاده از کنترل جهت ارزیابی کارایی ترانسفورماسیون و سلول ها و ممانعت از آلودگی , ضروری است

غربالگری

  • برای غربال نمودن کلنی های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده از آنتی بیوتیکی که ژن مقاومت به آن توسط وکتور نوترکیب حمل می گردد استفاده می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین
  • IPTG
  • X-Gal
  • پلیت های حاوی باکتری ترانسفورم شده

روش کار

  • ابتدا پلیت حاوی محیط کشت را به مدت 20 دقیقه زیر هود قرار داده تا به دمای محیط برسد. ( به این محیط کشت قبلا آمپی سیلین اضافه شده است) .
  • 40 میکرولیتر IPTG و 40 میکرولیتر X-Gal به سطح محیط کشت اضافه کرده و با غلطک شیشه ای پخش می شود و کمی فرصت داده می شود تا این مواد جذب محیط کشت شود.
  • با یک لوپ استریل از کلنی های سفید که به صورت تک می باشد برداشته و روی پلیت جدید کشت داده می شود. این کار برای اطمینان یافتن از صحت ترانسفورماسیون در کلنی های مورد نظر می باشد.
  • سپس پلیت ها به مدت یک شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند.
  • IPTG شناسایی پروموتور ویژه ژن Lac Z در فرادست ناحیه 5´ ژن و القاء رونویسی آن و تولید آنزیم بتا گالاکتوزیداز را بر عهده دارد. سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و آنزیم بتا گالاکتوزیداز را تولید کنند حاوی وکتور نرمال می باشند. اما سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و به دلیل وارد شدن قطعه DNA هدف این ژن قادر نباشند آنزیم فوق را تولید کنند حاوی وکتور نوترکیب می باشند.
  • X-GaL به عنوان سوبسترا برای بتا گالاکتوزیداز محسوب شده و بعد از تجزیه توسط این آنزیم ماده ای به رنگ آبی تیره در اطراف سلول های حاوی ژن فعال بر جای می ماند.وکتور نوترکیب به دلیل عدم آنزیم فوق نمی تواند X-Gal را تجزیه نماید در نتیجه کلنی های تشکیل شده سفید می باشند.

استخراج پلاسمید

روش لیز قلیایی به همراه دترجنت SDS بیش از 20 سال است که برای جداسازی پلاسمید از باکتری E.Coli  مورد استفاده قرار می گیرد. اگر سوسپانسیون باکتریایی با دترجنت های غیر یونی قوی در  pH بالا مجاور شود. دیواره باکتری تخریب کروموزوم و پروتئین های باکتریایی دناتوره و پلاسمید در محیط آزاد می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط LB Broth حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین
  • Suspension Buffer
  • RNase A
  • Lysis Buffer
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer
  • High pure filter tubes
  • Collection tube

روش کار

  • باکتری در محیط حاوی آمپی سیلین کشت داده می شود تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر به 5/1 تا 5 برسد.
  • 4-5/0 میلی لیتر از محیط سانتریوفوژ می شود تا سلول ها جدا شوند.
  • سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از محلول susprnsion buffer RNase تهیه می شود.
  • 250 میکرولیتر Lysis Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.
  • 350 میکرولیتر Binding Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در روی یخ انکوبه می شود
  • نمونه به مدت 10 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • محلول رویی به درون یک فیلتر تیوپ منتقل شده و 30 ثانیه تا 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • فیلتر توسط 700 میکرولیتر Wash Buffer شسته و فیلتر تیوپ به مدت 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • مایع تجمع یافته خارج شده , و 50 میکرولیتر Elution Buffer  یا   آب به آن اضافه می شود.
  • نمونه به مدت 1 دقیقه در 13200 rpm ساتریوفوژ شده و محصول انتهایی DNA پلاسمیدی تخلیص شده می باشد.

 

vistagene   vistagene   vistsgene   vistagene  vistagene   ویستاژن ویستاژن ویستا ژن  ویستا ژن  ویستا ژن

استفاده از مطالب سایت ویستاژن تنها با ذکر نام و لینک سایت و با هماهنگی با مدیریت  امکان پذیر می باشد.