سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش کشت بافت پرداخته است.

کشت بافت 

کاربرد روش های کشت آزمایشگاهی دانشمندان را قادر ساخته که سلول ها و بافت ها و یا اندام ها را از ارگانیسم مادری جدا کنند و آن ها را به عنوان واحدهای زیستی ایزوله شده در تحقیقات بعدی مورد بررسی قرار دهند. یک سلول ، برای اینکه بتواند در محیط کشت سلولی استفاده شود باید دارای قدرت تقسیم خود به خود باشد و این مورد امکان پذیر نیست مگر اینکه منبع کامل و دست نخورده کروموزومی داشته باشند در غیر این صورت نیاز به تحریک محیطی می‌باشد.

  • شرایط محیطی مناسب برای کشت دادن 

          1. استریل بودن محیط کشت 

اکثر میکروارگانیسم ها خیلی سریع تر از سلول های مورد نظر در محیط کشت رشد می‌کنند و در طی رشد خود نیز باعث تولید مواد سمی می شوند.

          2. لوله‌های کشت و سوبستراها 

      اثبات شده است که سلول های روی یک سطح با بار منفی به بهترین نحو ممکن رشد می‌کنند.

        3. محیط کشت و مواد افزودنی

هر محیط کشت ، نیاز به یک محلول نمکی نرمال دارد که برای کشت طولانی مدت ، مواد خاص پایدار دیگر افزوده شود.

        4.  مقدار PH محیط کشت 

میزان PH به محیط گازی کشت بستگی دارد .

       5.  درجه حرارت 

هر چه دمای محیط کشت بالاتر باشد، میزان رشد نیز بیشتر است تا اینکه به یک دمایی برسد که از آن دما بالاتر موجب انهدام سلولی شود.

      6. گازهای محیط کشت 

مرتبط با ترکیب های گازی مخصوصا دی اکسید کربن و اکسیژن می باشد.

 

 

کشت بافت

 انواع کشت بافت

  • کشت آمنیوسنتز (مایو آمنیونی) 

این نوع کشت در هفته‌های چهاردهم حاملگی و بعد از آن صورت می‌گیرد. مقدار حجم متناسب برای کشت سلولی 20 میلی لیتر می‌باشد. به طوری که دو مقدار مساوی 10 میلی‌لیتری از آن را برای بالا بردن درصد اطمینان در محیط های مختلف قرار می گیرد.
نمونه‌های بدست آمده را به دو قسمت تقسیم کرده بعد سانتریفوژ می‌نمایند. مایع آمنیونی تا 24 الی 48 ساعت بعد از نمونه برداری قابل کشت می‌باشد (در صورتی است که نمونه در یخچال نگهداری شود).

  • کشتهای بافت توده‌ای 

      1.پوست

از فرد بیمار ، پوستی به ضخامت 1 میلی متر و به قطر 4 میلی متر گرفته می شود، سپس چربی پوست را برطرف نموده و در محیط شستشو بلافاصله شسته می شود و یک شب در آن غوطه‌ور می‌کنند. نمونه‌های بزرگ تر معمولا از اجساد بدست می‌آید.

      2. جنین مرده

نمونه برداری از جنین و یا اینکه از کیسه جنینی انجام می‌گیرد.

     3. نمونه‌های ویلی کوریونی (CVS): در این روش باید دقت کرد که آلودگی سلول مادری در محیط کشت ایجاد نشود.

      4.محصولات حاملگی

این مورد برای مواد تخلیه شده از رحم بعد از پایان حاملگی اولیه و یا مواد حاصل از سقط خود به خودی بعد از سقط اولیه مورد استفاده قرار می گیرد .

  • کشت لنفوسیت 

گزارش اولیه در مورد تقسیم لکوسیت های خون محیطی در آزمایشگاه به سال 1915 برمی‌گردد.راحت‌ترین بافت قابل دسترسی خون محیطی می‌باشد که برای بررسی های کروموزومی در تشخیص سندروم های مختلف مورد استفاده قرار می گیرد و حتی این نوع محیط کشت ، به طراحی نقشه ژنی انسان نیز کمک شایان و قاب توجهی کرده است.

  • کشت سلول های هیبرید شده 

سلول ها در صورتی که همراه با ویروس کشته شده ،یا پلی اتیلن گلیکول کشت شوند باهم آمیزش می کنند، مانند هیبرید سلول انسان و سلول موش.
بخشی از سلول های ادغام شده، تا مرحله آمیزش هسته پیش می‌روند و قسمتی تا مرحله تقسیم سلولی هم پیشرفت می‌کند. به این صورت که هر دو سری از کروموزوم ها باهم تکثیر می شوند و سبب ایجاد یک آمیخته می شوند.
در برخی از این آمیخته‌ها ، یک سری از کروموزوم ها رفته رفته از بین می‌روند، مثل: کروموزومهای انسان. اما تعدادی از این کروموزوم ها باقی می‌مانند، که برای باقی ماندن مجبور به نوترکیبی با سری کروموزومی اند که باقی می‌ماند. چون درصد سلولهای آمیخته (هیبرید شده) زنده بسیار کم خواهد بود بنابراین به محیط ها کشت انتخابی نیاز است که شرایط زیست و زندگی را برای سلولهای آمیخته فراهم کند.

  • کشت سلول های ویژه مثل سلول های توموری

کشت سلول های توموری مثل کشت سلول های برخی بافت های اختصاصی بدن با اشکالاتی مواجه خواهد بود. ایجاد یک محیط کشت انتخابی برای سلول های توموری ، چندان پیشرفت نکرده است چرا که علی رغم رشد سریع توموری در موجود زنده ، این سلول ها در محیط آزمایشگاهی چندان رشد نمی‌کنند که این به دلیل استقلال سلول های توموری و عدم کنترل تکثیر آنها می‌باشد. اما با این وجود، توانسته اند با ایجاد شرایط تقریبا مساعد غذایی و هورمونی، ادامه حیات سلولهای توموری را در حد مطلوب یا در حد نگهداری قسمتی از سلول های کشت شده ممکن سازند.

 

●کاربرد کشت بافت 
  1. _بررسی فعالیت های درون سلولی مانند حرکت RNA از هسته به سمت سیتوپلاسم
  2. بررسی فعالیت بین سلولی مانند ساخت پروتئی
  3. بوم شناسی یا اکولوژی سلول های خاص (روابط موجود زنده با محیط) همچون دگرگونی در اثر عوامل بیماری زا
  4. تهیه واکسن های ویروسی
  5. بررسی موارد مربوط به خود سلول مانند : چگونگی چسبندگی به سلول های دیگر
  6. تشخیص سرطان ها
  7. بررسی واکنش های ایمنی مثلا با تولید پروتئین های مونوکلونال
  8. آنالیز ژنتیکی

گردآورنده: جناب آقای حسن مسرور

ویستاژن vistagene vista gene

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش کشت سلولی پرداخته است. در صورت داشتن سوال در این رابطه یا تجربه کاری، آن را در قسمت نظرات سایت ثبت کنید.

کشت سلول چیست؟

 فرآیندی که در آن سلول ها در شرایط خاص و کنترل شده‌ای؛ در بیرون از محیط بدن  پرورش و رشد داده شوند، کشت سلول گفته می‌شود.

 به زبان ساده تر می توان گفت کشت سلولی به فرآیندی گفته می شود که سلول های  یوکاریوتی در یک محیط کشت استریل شده، کشت داده می شود که هر سلول محیط کشت مخصوص خود را نیاز دارد. بطور مثال محیط کشت مصنوعی باید دارای مواد مغذی مثل ویتامین ها، مواد معدنی، قندها، آمینواسیدها، هورومون ها و گازها (CO۲)، و (O۲)، باشد. در این محیط کشت ها باید شرایط فیزیکی و شیمیایی نیز تنظیم شود.

 انواعی از سلول ها می توانند به صورت شناور در محیط کشت رشد و نمو کنند اما برخی برای رشد نیاز به یک سطح دارند تا بتوانند به آن متصل شوند. 

تاریخچه کشت سلولی

اولین بار در سال 1907 سوالی برای یک پزشک (اریسون) پیش آمد و با خود گفت: آیا من می توانم که شرایط آزمایشگاه را طوری تنظیم کنم که یک سلول بتواند در این شرایط زنده بماند…

و برای اینکار بافت مغزی قورباغه رادر مورد بررسی قرار داد و داخل ظرف کشت  همراه با مواد تغذیه ای گذاشت (علاوه بر بافتی که درون محیط قرار داد، محیط کشت نیز اضافه کرد،) محیط کشتی که آن موقع استفاده کرد، عصاره جنینی بود. جنین جوجه را گرفت و سانتریفیوژ کرد و روسوباتش ته نشین شد و محصول را به عنوان سرم برای کشت بافت مغزی استفاده کرد و بعداز مدتی دید که سلولها می توانند در یک محیط آزمایشگاهی کشت پیدا کنند و در این شرایط بمانند و در نتیجه توانست سلولها را برای بار اول در محیط آزمایشگاه کشت بدهد و کشت سلول را بنا کند، این ساده ترین حالت کار کردن بود.

 در سال 1970 انواع محیط های کشت معرفی شد، در اوایل دهه 70 برای کشت سلولی از سرم های گاوی ( FBS) استفاده می کردند ولی مشخص شد هر سلولی در هر محیطی نمی تواند رشد یابد و اکنون استفاده از این سرم به حداقل رسیده است.

به مرور زمان روش کشت سلولی پیشرفت کرد و محیط های کشت به سمت اختصاصی شدن پیش رفت و بعداز آن آرام آرام محیط های کشت کاملا اختصاصی طراحی شد، یعنی یک نوع محیط کشت فقط برای یک نوع سلول خاص است و عمومی نیست و این سبب شد که محیط های اولیه از حالت پایه ای به سمت پیشرفته و کامل پیش برود.

انواع محیط کشت سلولی

محیط کشت EMEM

دانشمندی بنام (ایگلز) برای اولین بار محیط پایه ای درست کرد که به آن FBS اضافه کرد که این محیط می تواند اکثر سلول ها را رشد دهد که به این محیط به اصلاح ایگلز مینیمم اسنشیال مدیوم (محیط ضروری پایه ای یا اولیه ایگلز) یا کمترین حالت می گویند.

محیط کشت DMEM

 دانشمند دیگری با این تفکر که می توان این محیط کشت حداقل را با قند و نمک مخلوط  کرده تا محیط بهینه تر شود که بتوان راحت تر از این محیط برای اکثر سلول ها استفاده کرد، یک محیطی آماده کرد تحت عنوان DMEM؛ که برگرفته از محیط EMEM است، فقط تغییراتی دارد یعنی محیط کشت حداقلی که تغییراتی در غلظت موادش ایجاد شده است.

حفظ و نگهداری سلول‌ها در محیط کشت

بیشتر سلول‌ها بعداز رشد و تکثیر تا حد خاصی، با وجود حفظ ثبات سلولی؛ تحت فرایند پیری قرار گرفته و تقسیم سلولی در آن‌ها متوقف می‌شود. سلول‌ها در یک انکوباتور سلولی با دما و مخلوط گازی مناسب (به‌ طور معمول دمای ۳۷ درجه و %۵ co2 برای سلول‌های حیوانی) کشت داده می‌شوند. شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت است.

محیط های کشت می‌توانند از  نظر غلظت گلوکز، pH، فاکتورهای رشد و دیگر مواد مغذی با یکدیگر متفاوت باشد. اغلب محیط‌های کشت حاوی فاکتورهای رشدی مانند سرم خون حیواناتی همچون سرم جنین گاوی (FBS)،سرم اسب، سرم گوساله گاوی یا سرم بز هستند.

شرایط شروع کار کشت سلولی

 وقتی می خواهیم کشت سلولی انجام دهیم یا محیط کشتی درست کنیم ملزم می باشیم در مکانی آزمایشات خود را پیش ببریم که تجهیزات آزمایشگاهی وجود داشته باشد یا به تجهیزات کشت سلول مجهز باشد که اعم از: هود، ترازو، آنکوباکتور (هود کنار آنکوباکتور نباشد) و شرایط استاندارد و…  که  باید شرایط و ویژگی های خاصی را دارا باشد،یا مثلا قرار گرفتن آزمایشگاه کشت سلول در مکان پرتردد کاملا غلط می باشد.باید از آزمایشگاهی استفاده کرد که بتوان هرچند مدت یک بار آنجا را ضدعفونی کرد. درب ازمایشگاه باید همیشه بسته باشد و  سطح دیواره های آزمایشگاه باید  صاف و صیقلی باشد و با رنگ روشنی رنگ شده و ضد آب باشد تا بتوان به راحتی و سهولت آن را استریل و تمیز نمود.

در فرآیند کشت سلول باید محیط یا آزمایشگاه کاملا استریل و ضدعفونی شده باشد و بهتر است درون اتاقی یا آزمایشگاهی که این فرآیند انجام می شود تهویه هوا وجود داشته باشد و در نزدیکی آزمایشگاه کشت سلول نباید بافت اولیه حیوانی کشت شود. برای عملکرد بهتر رشد و پرورش سلول ها باید به روش ها و دستورالعمل های کار در اتاق کشت سلولی دقت شود. در فرصت های زمانی مناسب باید فیلترهای هود لامینار را چک و در صورت لزوم تعویض کرد و قبل و بعداز انجام کار باید حتما تمام سطوح هود با الکل تمیز شود. آب آنکوباتور باید به صورت ماهانه با استفاده از الکل 70% استریل شود. برای انجام دادن آزمایش کشت سلول باید از ظروفی استفاده کرد که یکبار مصرف باشد مثلا ظروف پلی استایرن (باید به این نکته دقت داشت که از ظروفی استفاده شود که فضای مناسب و کافی برای رشد سلول ها در اختیار سلول بگذارد) همانطور که قبلا گفته شد می توان از وسایل یا تجهیزات آزمایشگاهی که در کشت سلول وجود دارد استفاده کرد مثل فلاسک ها یا پلیت های مجهز که سلول های ایزوله شده، بافت ها یا اندام ها یا سلول هایشان می توان در ظروف پلاستیکی یا شیشه ای (فلاسک) با درجه حرارت تنظیم شده در انکوباتور نگهداری کرد.

اگر به رشته زیست شناسی علاقه دارید. مقالات زیر می تواند برای شما مفید باشد.

مقاله بافت شناسی

مقاله مبانی سلولی و مولکولی

مقاله نکات ایمنی در آزمایشگاه

گردآورنده: سرکار خانم پریناز زارع 

vistagene vistagene ویستاژن ویستازن کشت سلول کشت سلولی کشت سلول