استخراج DNA از خون

,

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش استخراج DNA از خون پرداخته است.

کاربرد های استخراج DNA از خون

جهت انجام بررسی های مولکولی ، تشخیصی پزشکی ، مهندسی ژنتیک ، پزشکی قانونی استخراج DNA از سلول ها ضرورت دارد.

همچنین در تهیه ی داروهای نوترکیب یکی از روش ها استخراج DNA است. داروهایی که به این ترتیب ساخته می شوند یعنی از طریق ژنتیک نوترکیب شامل : هورمون رشد گاوی (bVh) و هورمون رشد انسان (hGh) است. علاوه بر این ها و تعدادی از هورمون های دیگر، تولید انسین نیز یکی از بیشترین ها است .

سلول های خونی تشکیل شده از گلبول های قرمز، گلبول های سفید و پلاکت ها هستند .
گلبول های قرمز در انتقال اکسیژن به سلول ها و دفع دی اکسید کربن از سلول ها نقش دارند، گلبول های سفید در ایمنی بدن نقش دارند و پلاکت ها درهنگام جراحت در لخته شدن خون با ترشح فاکتور های انعقادی نقش دارند.
اما برای استخراج DNA از خون تنها از گلبول های سفید می توان استفاده کرد. زیرا بقیه ی سلول های خونی فاقد هسته هستند و در نتیجه DNA ندارند.

برای استخراج DNA از خون پروتکل های مختلفی وجود دارد که یکی از آن ها را به صورت کلی در اینجا به عنوان نمونه معرفی می کنیم.

برای استخراج DNA از گلبول های سفید از دو روش فیزکی و شیمیایی استفاده می کنند، در روش فیزیکی کاری می کنند که منجر به شکست غشا و خارج شدن ماده ی ژنتیکی می گردد مانند انجماد، شوک گرمایی، له کردن با سانتریفیوژ و… و در روش شیمیایی از دترجنت ها و آنزیم ها برای لیز کردن غشا استفاده می کنند.

مراحل انجام استخراج DNA از خون

پس از گرفتن نمونه ی خون از فرد داوطلب آن را داخل فالکون حاوی هپارین (ضد انعقاد) ریخته و به خوبی مخلوط می کنیم.

حال باید پلاسما را از سلول های خونی جدا کنیم برای این کار خون را در ویال ریخته و سانتریفیوژ می کنیم (با سرعت 10000 rpm به مدت ۴ دقیقه ) البته ممکن است این اعداد در مقالات و پروتکل های مختلف کمی متفاوت باشد .
سپس مایع رویی را دور ریخته و سلول های ته نشین شده را حفظ می کنیم .
در مرحله ی بعدی به ویال حاوی رسوب محلول لایزیز بافر را اضافه می کنیم و با همان سرعت و همان زمان مجددا عمل سانتریفیوژ را انجام می دهیم. 
رسوب تشکیل شده حاوی هسته ی گلبول های سفید و پلاکت هاست. 
و مایع رویی که حاوی غشای تکه تکه شده ی گلبول های سفید و قرمز است را دور می ریزیم.
حال می بایست پلاکت ها را که در واقع ماهیت پروتئینی دارند از بین ببریم تا بتوانیم از هسته ی حاوی DNA جداسازی کنیم. 
برای این کار از آنزیم های تجزیه کننده ی پروتیئن استفاده می کنیم و سپس از آنزیمی استفاده می کنیم که باعث یکدستی چسبیدن پروتئین های تکه تکه از هم شود تا سنگین شوند و کف ویال با سانتریفیوژ مجدد رسوب کنند. 
حال مایع حاوی هسته را در ویال جدا گانه میریزیم و سپس به آن بافری اضافه می کنیم که باعث تخریب غشای هسته و خارج شدن DNA و RNA گردد. 
بعداز اضافه کردن بافر دوم دوباره عمل سانتریفیوژ را تکرار می کنیم و رسوب حاوی DNA و RNA را نگه میداریم.

جهت تخلیص DNA از دو مرحله استفاده می کنیم

اول به رسوب الکل ۹۹٪جهت لیز شدن پروتئین های اضافی استفاده می کنیم
و سپس مرسوب را به کاغذ صافی منتقل کرده و آنزیم RNAase را اضافه کرده تا RNA از بین رود و فقط DNA باقی بماند. DNA را با بافر TE به حالت سوسپانسیون درآورده جهت انجام آزمایشات مختلف نگهداری می کنیم.

لازم به ذکر است استفاده از کیت های استخراج DNA ساده ترین روش است زیرا این کیت ها خودشان داری پروتکل هستند.

گردآورنده : جناب آقای محمد حسین حامیانفر

/7 دیدگاه /توسط

مشاوره تحصیلی

,

هر راهنمایی صحیح سنگی است که از مجموعه ی آن ها بنای زندگی تو ساخته می شود.

       …(   آلبرت انیشتین  )…

مشاوره تحصیلی

منظور از مشاوره تحصیلی ارائه اطلاعات لازم برای افزایش موفقیت تحصیلی است. راهنمایی و مشاوره یک فرایند بسیار مهم و استثنایی در حل مشکلات و معضلات است. سایت ویستاژن مفتخر است شما را در این راه همراهی کند.

مشاوره تحصیلی درموارد زیر کمک کننده است

_ روشهای یادگیری

_ انتخاب رشته تحصیلی در دبیرستان یا دانشگاه

_ مدیریت زمان

_ کاهش استرس

_ افزایش اعتماد به نفس

_ افزایش تمرکز

_ برنامه تحصیلی

_ اصلاح مطالعه

_ درمان اضطراب

_ درمان اختلالات یادگیری

و بسیاری از موارد دیگر ، برای دانش آموز و یا دانشجو کمک کننده و مفید باشد.

ضرورت مشاوره ی تحصیلی 

نقش راهنمایی و مشاوره در آموزش و همچنین پرورش افراد به حدی حایز اهمیت است که عده ای از صاحب نظران آن را نوعی تعلیم و تربیت گفته اند و بعضی راهنمایی را تسهیل کننده ی جریان تعلیم و تربیت می دانند.

وقتی مشاوری را می بینید به سادگی می توانید در مورد هر موضوعی که مورد نظرتان است با وی صحبت کنید. مشاور از شما مشتاقانه سؤالاتی می کند که بتواند شما را یاری نماید تا همه ی جوانب مسأله تان را دریابید. اگر شما در صحبت کردن با مشاور دچار مشکل هستید، او به شما کمک می کند تا آن دشواری را پشت سر بگذارید.

مشاورین از روش های متنوعی مانند آرامش بخشی، ابراز وجود یا حساسیت زدایی تدریجی و تقویت رفتارهای جدید استفاده می کنند. در بعضی مواقع ممکن است حوادث گذشته که هنوز اثرات آن بر شما باقی است مورد بحث قرار گیرد.

مشاوره بخشی از خدمات حوزه ی معاونت دانشجویی و فرهنگی می باشد که در مرکز مشاوره دانشجویی دانشگاه ها و شعبات آن قابل دسترسی است. این خدمات معمولاً برای دانشجویان رایگان است. زمان جلسه ی مشاوره بر اساس یک قرار مشخص شده قبلی از طریق پذیرش مرکز تعیین می شود و ادامه ی جلسات آن بر اساس قرارهای بعدی و هماهنگی با خود مشاور تعیین می گردد.

سخن آخر ،طبیعی است که در اولین ملاقات با مشاور کمی نگران باشید اما اطمینان داشته باشید که در دیدار های بعد احساس راحتی بیشتری خواهید کرد، فقط کافی است قدم اول را بردارید…

نویسنده : جناب آقای حسن مسرور

/10 دیدگاه /توسط

  انواع مقاله

سایت ویستاژن به معرفی انواع مقاله و ویژگی های هر کدام از آن ها پرداخته است. با ما همراه باشید. 

انواع مقاله و ویژگی های آن

مقاله ها معیاری هستند برای سنجش میزان فعالیت علمی دانشمندان و پژوهشگران و دانشگاه ها در یک کشور. مقاله مانند سندی بر درستی یک تحقیق یا پژوهش است. یافته های علمی پژوهشگران از طریق مقالاتشان در زمانی کوتاه در اختیار دیگران قرار می گیرد . دانشگاه های زیادی هستند که در پذیرش دانشجویان در مقطع دکترا اهمیت زیادی در این موضوع قائل هستند و شخصی که دارای مقالات معتبر و متعدد می باشد شانس بیشتری در پذیرش این دانشگاه ها دارد .

حال می بایست به این سوال پاسخ دهیم که مقاله چیست و په ویژگی هایی دارد ؟

معنی لغوی مقاله می تواند نقل قول از یک مبحث در یک کتاب باشد . در واقع مقاله شیوه ای از نوشتار است که در دانشگاه ها و پژوهش سرا ها  رواج دارد .

مقالات گوناگونی و گستردگی زیادی دارند اما می توان آن ها را به سه دسته ی اصلی تقسیم کرد.

  • اولین دسته را به مقالات اجتماعی اختصاص می دهیم . در این دسته بیشتر به مسائل اجتماعی اعم از هنجار ها ، ارزش ها

، مشکلات یک جامعه و …. پرداخته می شود.

  • دومین دسته را به مقالات تحقیقی اختصاص می دهیم که بر گرفته از تحقیقت و پژوهشاتی است که اخیرا به اتمام رسیده است .
  • سومین دسته را به مقالات پژوهشی اختصاص می دهیم که در این گروه بعد از تحقیقات انجام شده به کمک روش های علمی و آزمایشات گوناگون به بررسی تحقیق پرداخته می شود در پایان نتایج بدست آمده مورد تحلیل و بررسی قرار می گیرد . این دسته از مقالات خود می تواند بر اساس محتوایش به چندین دسته مختلف تقسیم شود . که در ادامه به بررسی هر یک می پردازیم .
  • اولین دسته را قبلا توضیح داده ایم و همان مقاله تحقیقی است که بر اساس تحقیقی است که اخیرا انجام شده است .
  • دومین دسته مقالات مروری هستند . در این دسته از مقالات تحقیق یا پژوهش جدیدی انجام نشده است و در واقع مقالات مروری مقالاتی هستند که معمولا تمام موارد و نکات در مورد یک موضوع خاص گرد آوری شده و یک جا جمع می شود و ممکن است به یک تحلیل و بررسی کلی در رابطه با این موضوع خاص بینجامد. (برای نوشتن مقاله می توانیم از مقالات مروری در رابطه با موضوع مورد نظرمان استفاده کنیم چرا که همه ی موارد و نکات و مطالب مورد نظر ما در این مقالات هستند . )
  • سومین دسته مقالات گرد آوری هستند . این دسته نیز مانند مقالات مروری به بررسی موضوعی جدید نمی پردازد و در واقع سعی بر این دارد تا تمام دیدگاه های ثبت شده در رابطه با موضوعی خاص را گرد وآری و در یک جا جمع کند. تفاوت این گروه با مقالات مروری در این است که بر خلاف مقالات مروری تمامی نوشته های گذشته را تحلیل و بررسی نمی کند .
  • چهارمین دسته مقالات تحلیلی هستند .( به مقالات نظری نیز مشهورند . ) در این گروه نویسنده یا محقق با بررسی نظریات قبلی در رابطه با موضوع مورد نظرش ، آن ها را ادامه داده یا مورد شک قرار می دهد و نظریه خود را در این رابطه بیان می کند .

حال ببینیم که یک مقاله پژوهشی خوب باید چه ساختاری داشته باشد …

ساختار کلی یک مقاله پژوهشی  می تواند به صورت زیر باشد 

  • در ابتدا باید عنوان مقاله را بنویسیم . که می بایست با مباحث مطرح شده در مقاله در ارتباط باشد . خوب است که در انتخاب و نوشتن عنوان دقت شود چرا که اولین بخشی از مقاله ی ماست که نمایان می شود . شیوایی ، رسایی و واضح بودن از ویژگی های یک عنوان خوب است.
  • نوشتن نام نویسنده یا نویسندگان مقاله به همراه ادرس الکترونیکی هر یک از آن ها امری لازم است .
  • در این قسمت خلاصه و چکیده ای از مباحث مطرح شده در مقاله اعم از آزمایشات و روش هایشان نکات کلیدی و مهم و … قرار می گیرد و به بخش چکیده معروف است .
  • لغات و واژه های کلیدی بخش دیگری از مقاله است که در این قسمت حدود 7 واژه پر تکرار و مهم در مقاله ذکر می شود .
  • حال نوبت به نوشتن مقدمه است . در مقدمه به توضیح مسائل و مباحث به صورت اجمالی پرداخته می شود. همچنین لازم است دلایل و اهمیت پژوهش انجام شده بیان شود . به طوری که مطالعه کنندگان با خواندن مقدمه کاملا آن را درک کنند .
  • در قسمت بعدی روش های مورد استفاده در آزمایشات ، نمونه گیری ها و … را توضیح می دهیم .
  • در اینجا با کمک نمودار ها و جداول به توضیح نتایج و یافته های تحقیقاتمان می پردازیم .
  • بعد از مرحله ی ثبت نتایج ، حال نوبت بحث و صحبت راجع به یافته هایمان است . آیا این نتایجی که بدست آورده ایم با یافته های گذشته هم خوانی دارد ؟ ایا آنها را نقض می کند ؟ در پایان نیز خوب است که پیشنهاداتی برای پژوهش های آتی ارائه دهیم .
  • در اخر می بایست منابع مورد استفاده خود اعم از مقالات و کتاب های مختلف را ذکر کنیم . رفرنس دهی و ارجاع مطالب خود مبحثی جداست که در این مقال نمی گنجد و می توانید به صورت جدا این بخش را مطالعه کنید .

در بخش پایانی این مطلب می خواهیم به بررسی اجمالی مقالات  ISI  بپردازیم :

همانطور که پیش تر گفته شد مقاله ها معیاری هستند برای سنجش میزان فعالیت علمی دانشمندان و پژوهشگران و دانشگاه ها در یک کشور و اعتبار  مقاله نیز همچون یک کمیت فیزیکی دارای واحد های برای اندازی گیری است.

ISI   یکی از این میزان های ارزیابی اعتبار یک مقاله در سطح جهانی است .

ISI  مخفف شده کلمه ی (Institute for Scientific Information)  به معنی موسسه ی اطلاعات علمی است که توسط یوجین گار فیلد در سال 1960 پایه گذاری شد.  ISI  به صورت ویژه و اختصاصی بر روی اعتبار سنجی مجلات و مقالات علمی کار می کند . این موسسه هر ساله به بررسی مجلات علمی انگلیسی زبان پرداخته و با توجه به معیار هایی که دارد ، تعدادی از آن ها را که مورد تایید است به اصطلاح نمایه می کند . ممکن است یک مجله یک سال مورد تایید و سال  دیگر مورد تایید نباشد . این مجلات بر اساس شاخصی به نام ضریب تاثیر گذاری    (impact factor ) رتبه بندی می شوند که معیار خوبی برای اعتبار سنجی یک مجله است .

حال سوال پیش می اید که ضریب تاثیر گذاری چیست و چگونه محاسبه می شود ؟

در پاسخ به این سوال باید گفت که ضریب تاثیر گذاری (impact factor ) همه ساله توسط موسسه اطلاعات علمی  (ISI )  و بر اساس ارجاعات علمی به یک مجله محسبه می شود. نحوه ی محاسبه آن هم به این صورت است که تعداد کل ارجاعات به آن مجله در طول یک دوره زمانی مشخص (معمولا 3 سال ) تقسیم بر تعداد کل مقالات آن مجله در آن دوره زمانی . به طور مثال اگر 50 بار در طول 3 سال به مقالات یک مجله ارجاع شود و در این مدت 100 عدد مقاله در این مجله به چاپ رسیده باشد ضریب تاثیر گذاری این مجله 0.5 خواهد بود .

هرچه ضریب تاثیر گذاری یک مجله بیشتر باشد نشان دهنده اعتبار بیشتر آن مجله است .

حال ببینیم چگونه می توان فهمید که یک مجله  ISI  هست یا خیر !

برای این کار از موتور جستجوی گوگل و به کمک یک روش خاص استفاده می کنیم به این صورت که نام ژورنال مورد نظر را داخل یک کاما قرار داده سپس در مقابل آن عبارت site:thamsonreuters.com  نوشته و سرچ می کنیم .

 در کشور ما  معمولا تنها به مقالاتی بها داده می شود که در مجلات معتبر علمی نمایه شده توسط  ISI  به چاپ رسیده باشند . چاپ مقاله در این مجموعه نه تنها به خود تحقیق بلکه به نویسنده و کشور آن نیز اعتبار می بخشد .

گردآورنده : جناب آقای صادق صادقی 

/11 دیدگاه /توسط

استریلیزاسیون در آزمایشگاه

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیخ انواع روش استریلیزاسیون پردا خته است.در صورت داشتن سوال؛آن را با کارشناسان ما در میان بگذارید.

استریل کرن

سترون سازی یا استریل کرن (به انگلیسی sterilization) به روشی گفته می شود که برای از بین بردن و نابودی همه ی ارگانیسم ها مانند: اسپورها و عوامل انتقال دهنده آنها که شامل: باکتری،هاگ باکتری، قارچ و‌ ویروس ها از سطح اجسام، از روش های فیزیکی و شیمیایی استفاده می کنند. به معنای واقعی می توان گفت؛ منظور از استریلیزاسیون جلوگیری کردن از انتقال عفونت می باشد و از بین بردن کامل باکتری یا قارچ و…. و یا دیگر میکروارگانسیم های بیماری زا و غیربیماری زا. یا به زبان ساده تر یعنی از بین بردن میکروب ها.

فرآیند و روش استریل کردن بستگی به جنس تجهیزات دارد

  • روشهای گرمایی خشک(فوور)
  • گرمایی مرطوب(اتوکلاو)
  • رادیواکتیو(پرتو گاما) 
  • فیلتراسیون

 
باید بعد از هر استریل کردن مطمئن شد که همه ارگانیسم ها در این فرآیند از بین رفتند که می توان از روش های شیمیایی و یا بیولوژیک و پایش یا فیزیکی (دستگاه ارزیابی می شود) استفاده نمود.
برای نمونه می توان گفت دقت و‌ بررسی از سالم عقربه های درجه حرارت، فشار یا زمان. در بحث پایش شیمیایی از نشانگرهایی مثل نوار یا برچسب یا موارد دیگر استفاده می کنند که توانایی تغییر رنگ داشته باشند.
برای مثال نوارهایی موجود است جهت بررسی فعالیت صحیح اتیلن ، که در صورت سلامت فعالیت دستگاه برچسب یا نوار از رنگ قهوه ایی به سبز تغییر رنگ پیدا می کند.
 برای پایش بیولوژیک ، اسپورهای باسیلوس سوبتیلیس و باسیلوس‌استئاروترموفیلوس مورد استفاده قرار می گیرد که نشانگرهای این بحث به صورت های مختلفی هستند، که عبارتنداز: ویال، آمپول کوچک،این نشانگرها در داخل محفظه اتوکلاو و داخل سینی قرا دارند و باید فعالیت دستگاه را بصورت هفتگی یا ماهانه بررسی کرد. برای استفاده از مواد شیمیایی می توان با اضافه کردن غلظت و یا افزایش دادن مدت زمان به منظور استریل سازی استفاده کرد.
در دهه های اخیر برای استریل کردن یا استریلیزاسیون از پرتوها، گازهای شیمیایی، دما، مواد و ترکیبات ضدعفونی کننده و داروهای میکروب کش و‌ صافی های ویژه مورد استفاده قرار می گیرد.
در وهله اول به عنوان ساده ترین و موثرین روش سترون کردن می توان شعله را نام برد که دقت عمل این روش می تواند زیاد باشد و علاوه براین سریع ترین روش برای سترون کردن وسایل و ابزار آزمایشگاهی است، و باید توجه داشت وسایلی که به این روش استریل می شوند، باید نسبت به شعله مقاوم باشند و بعد از سرد شدن استفاده شوند.

 روش های مختلف استریل کردن

 

۱.گرمای خشک

در این روش دو عامل دما و زمان زیاد دخالت دارند و این روش با دستگاهی به نام آون صورت می پذیرد که دمای درونی آن تا۲۰۰ درجه می تواند افزایش بیابد.

۲.گرمای مرطوب

این روش تحت فشار استریل کردن در دستگاهی به نام اتوکلاو انجام می پذیرد که سبب می شود مواد پروتئینی زودتر و بهتر منجمد شوند. و در نتیجه کارآیی آن در از بین بردن سلول های میکروبی بیشتر از گرمای خشک باشد‌.

۳.پرتودهی

سترون کردن به صورت پرتودهی به ۳بحث تقسیم میشود

  • پرتوهای یوننده مانند اشعه گاما
  • اشعه فرابنفش
  • اشعه ایکس
    در این بین اشعه فرابنفش کاربرد وسیعی دارد ولی چون از آب، مایعات و یا پلاستیک شفاف و شیشع عبور نمی کند، به همین دلیل برای استریل کردن سطح های عریان استفاده می شود.
    پرتوهای یوننزه مانند پرتو گاما برای استریل کردن مواد غذایی، فرآورده های پزشکی و سایر مواد متراکم کاربرد دارد که می توان مثال زد: کاربرد پرتو گاما در استریل کردن خاک مورد استفاده قرار می گیرد.

۴- استفاده از صافی

روش دیگر درمورد استریل کردن که مورد استفاده قرار می گیرد صافی است که نسبت به دما، پرتو یا گازهای شیمیایی حساس می باشد.

 

گردآورنده : سرکار خانم پریناز زارع

ویستاژن vistsgene vistagene  استریلیزاسیون

/16 دیدگاه /توسط

طراحی پرایمر

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح طراحی پرایمر و آموزش آن پرداخته است.

طراحی پرایمر و کاربردهای آن

برای تکثیر قطعه ای از ژنوم به منظور انجام فعالیت هایی همچون بررسی بیان ژن،انگشت نگاری ژنومی،تشخیص هویت افراد،بررسی اختلالات ژنومی و بیماری های ژنتیکی،بیماری های ویروسی و…توسط PCR، وجود توالی کوتاهی به نام پرایمر ضروری است. در واقع، نیاز است برای شروع فعالیت آنزیم های دی ان ای پلیمراز که رونوسی از دی ان ای را انجام می‌دهند، ابتدا چند نوکلئوتید اولیه رشته مورد نظر رونویسی شده باشد تا آنزیم نوکلئوتید های مکمل بعدی را به آنها اضافه کرده و این عمل را تا پایان همانند سازی ژن انجام دهد.

در شرایطی که می‌خواهیم دی ان ای را در آزمایشگاه تکثیر کنیم، به دلیل عدم حضور آنزیم های سازنده‌ی پرایمر،نیاز است پرایمر را از قبل طراحی کرده و در شرایط آزمایش در مجاورت سایر عوامل قرار دهیم. این عمل اصطلاحا طراحی پرایمر نام دارد و برای انجام آن می‌توان از سایت ها و نرم افزارهای مرتبط بهره برد.

طراحی پرایمر اصولی را داراست که با رعایت آنها، می‌توانیم کیفیت و بازدهی واکنش را بالا ببریم.در این مقاله ابتدا به برخی از مهم‌ترین این اصول اشاره و سپس چگونگی طراحی پرایمر را بررسی می‌کنیم.

ویژگی‌های پرایمر مناسب

1.طول پرایمرها بین 18 تا 23 جفت باز باشد. کوتاه بودن پرایمر سبب اتصال‌ غیراختصاصی‌ شده و اقزایش طول پرایمر هیبریداسیون‌ را سخت می کند.

2.دمای ذوب (Tm) دو پرایمر به هم نزدیک  و در حدود 55 تا 65 درجه باشد.

3.دمای ذوب پرایمرها به دمای اتصالشان  (annealing) نزدیک باشد.

4.درصد CG پرایمر ها با هم برابر و حدودا 45 تا 60 درصد باشد.

5.پرایمر ها اختصاصی عمل کنند یعنی در کل ژنوم گونه‌ی مورد مطالعه،فقط توانایی اتصال به توالی مورد نظر ما را داشته باشند.

6.پرایمر تشکیل دایمر خودی (Self-dimer) ندهد؛ برای این منظور بهتر است قطعه ای انتخاب شود که درصد بازهای مکمل کمی داشته باشد(مثلا دارای G و T غالب باشد).

7.پرایمر تشکیل دایمر متقابل (Hetero-dimer) و ساختار سنجاق سری (Hairpin) ندهد.

با در نظر گرفتن موارد بالا می‌توانیم پرایمر مناسب را برای انجام  PCRطراحی کنیم.

برای طراحی پرایمر در ابتدا بایم مشخصات و توالی ژن مورد نظر را بررسی کنیم؛بدین منظور می‌توانیم از سایت‌هایی از جمله NCBI و  UCSCاستفاده کنیم و نام ژن مورد نظر و گونه مورد مطالعه را در بخش مربوطه جست‌و‌جو نماییم.

طراحی پرایمر در سایت :NCBI

در قسمت nucleotide این سایت،نام ژن و گونه مورد نظر را سرچ میکنیم و مشخصات ژن نمایش داده می‌شود،با کلیک بر روی گزینه FASTA می‌توانیم توالی ژن موردنظر را بطور کامل مشاهده کرده و سپس برای محدوده موردنظر خود،با توجه به موارد گفته شده بهترین پرایمرهای ممکن را انتخاب کنیم.پرایمر Forward عیننا کپی قسمتی از توالی ژنوم و پرایمر reverse مکمل و معکوس قسمتی از توالیست(زیرا توالی بصورت’5 به ‘3 می‌باشد). علاوه بر موارد مشاهده شده،بهتر است اولین نوکلئوتید در سر ‘3 (یعنی در پرایمر reverse) یک پورین (C یا G) باشد.زیرا اتصال سر ‘3 به پرایمر بسیار مهم است و چون بین بازهای پورینی سه پیوند هیدروژنی برقرار می‌شود،اتصال محکم خواهد بود. اما بطور کل باید سعی شود انتهای ‘3 غنی از پورین نباشد،زیر افزایش مقدار پورین باعث کاهش اختصاصیت واکنش خواهد شد.

پس از انتخاب پرایمرها، می‌توانیم در قسمت primer-blast همین سایت،اختصاصی بودن پرایمر ها را بررسی کنیم. برای این کار توالی پرایمر های forward و  reverseرا در کادرهای مربوطه وارد کرده و در قسمت پایین صفحه نوع ارگانیسم را انتخاب میکنیم. سپس با کلیک برروی گزینه Get primers نتیجه را خواهیم دید. در صفحه نتیجه، تمام توالی هایی را که در ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه، امکان اتصال به این پرایمرها را دارند،مشاهده خواهیم کرد. اگر بیش از یک توالی مکمل پرایمرها باشد،یعنی پرایمر طراحی شده اختصاصی عمل نکرده و مناسب نمی‌باشد.

دیگر نکته ی قابل توجه در این بخش self-3 complementarity است.در واقع این مشخصه بیان می کند که سر ‘3 چقدر تمایل دارد به خودش متصل شود. هرچه این عدد کمتر باشد مناسب تر است و برای داشتن پرایمر قابل قبول بهتر است self-3 complementarity  بین 0 تا 2 باشد.

Self-complementarity برآیند کل بوده و مجاز است عدد بزرگتری را به خود اختصاص دهد. (حدودا تا 5)

طراحی پرایمر در سایت UCSC:

اگر نخواهیم طراحی پرایمر را بصورت دستی انجام دهیم،می‌توانیم از پرایمرهای از پیش طراحی شده سایت UCSC استفاده کنیم. برای استفاده از این سایت درقسمت Genome نام ژن موردنظر را جست و جو می‌کنیم و سپس در صفحه ی نتیجه،UCSC Genes را انتخاب می‌کنیم. حالا روی قسمت Exon Primer  کلیک کرده و در صفحه نمایش داده شده submit را انتخاب می‌کنیم.

پس از کلیک بر روی Results پرایمرهای مناسب محدوده‌ی مورد نظر ما،با تمام خصوصیات از جمله طول قطعات و دمای ذوب و درصد GC ظاهر می‌شوند.همچنین جایگاه پرایمرها برروی ژنوم قابل مشاهده است.

در قسمت پایین تر این صفحه، در بخش  ADDITIONAL OLIGOS سایت پرایمرهای بیشتری را به ما پیشنهاد می کند تا با توجه به مشخصات آنها بهترین پرایمر را انتخاب کنیم.

همچنین می‌توانیم طراحی پرایمر را با کمک سایت primer3 انجام دهیم.

طراحی پرایمر در سایت Primer3:

برای این کار باید توالی خاصی که قصد تکثیر آن را داریم را در دست داشته باشیم،این توالی را هم از سایت NCBI و هم از سایت UCSC می‌توانیم بدست بیاوریم. بهتر است از قسمت‌هایی که نواحی مختلف ژن شامل اگزون و اینترون را به تفکیک نشان می‌دهند استفاده کنیم. سپس توالی هدف خود را پیدا کرده و قسمت هایی از رشته که قبل و بعد از قطعه هدف ما قرار دارند را انتخاب کنیم. برای مثال اگر قصد تکثیر اگزون خاصی را داریم، میتوانیم ژن مورد نظر را در بخش GENE سایت NCBI  جست و جو کنیم. در صفحه ی نتیجه خطوط باریک اینترون‌ها و قطعات پهن تر اگزون ها می‌باشند. برای مثال اگر توالی هدف ما اینترون چهارم این ژن باشد،با انتخاب قسمت‌های حوالی این ژن و سپس انتخاب گزینه Zoom on range روی قسمت مورد نظر zoom می‌کنیم.

سپس می‌توانیم یک بار با نشاندار کردن ناحیه ی اگزونی و انتخاب گزینه download selected،توالی اگزون را دانلود کرده و بار دیگر به همین روش توالی اگزون به همراه مقداری از اینترون های اطراف را دانلود و save کنیم. توالی ای که شامل اینترون و اگزون است را انتخاب کرده و در سایت primer3 داخل کادر بالا کپی می کنیم.

حال اگر چند نوکلیوتید از ابتدای اگزون کپی کرده و در سایت Primer3 ، Ctrl+F را بزنیم، ابتدای اگزون بصورت رنگی مشخص خواهد شد. به همین ترتیب می توانیم انتهای اگزون را نیز پیدا کنیم.

سپس ابتدا و انتهای توالی موردنظر خود (در اینجا اگزون) را  توسط  علامت های [  و ] محدود می‌کنیم تا پرایمر ها خارج از محدوده‌ی مورد نظر ما طراحی شده و توالی هدف کاملا تکثیر شود.

می‌توانیم در بخش General setting و Advanced setting تعداد جفت پرایمرهایی که می خواهیم در نتیجه مشاهده کنیم،طول قطعه ای که می خواهیم تکثیر کنیم و ویژگی های پرایمرها از جمله دمای ذوب و درصد CG و… را مشخص کنیم.

Pick Primers را انتخاب می‌کنیم و نتیجه بصورت زیر ظاهر می‌شود.

در نتایج بدست آمده جفت پرایمری را که بهترین شرایط را داراست انتخاب میکنیم.

در این مرحله برای اطمینان از اختصاصیت پرایمرها، می‌توانیم از قسمت PCR  همین سایت و یا از قسمت blast سایت  NCBI به ترتیب ذکر شده استفاده نماییم.

جهت بررسی پرایمرها از نظر تشکیل انواع دایمر و یا Hairpin  می بایست از سایت Oligo analyzer  استفاده کنیم. پس از ورود به بخش Oligo analyzer tools توالی هر یک از پرایمر ها را در کادر مشخص شده وارد و گزینه hairpin را انتخاب می‌کنیم.

به طریق مشابه از لحاظ ایجاد self-dimer بررسی می کنیم . مشخصه ی مهم  Delta G واکنش است که هر چه منفی تر باشد به این معناست که تمایل پرایمر برای ایجاد دایمر بالاتر است. به طور کلی عدد  Delta G تا حدود منفی 9 قابل قبول است اما بسته به این که پرایمر را دقیقا برای چه کاری مورد استفاده قرار می دهیم این عدد متغیر خواهد بود.

سپس گزینه hetero-dimer را انتخاب کرده و توالی های forward و reverse را وارد می‌کنیم و پس از کلیک روی calculate،   Delta G واکنش را بررسی می کنیم.

گردآورنده: سرکار خانم لیلا تنهایی

/10 دیدگاه /توسط

دستگاه الایزا ریدر چیست؟

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح دستگاه الایزا ریدر و کاربردهای آن پرداخته است.

دستگاه الایزا ریدر

الایزا ریدرها که به آنها پلیت ریدر و یا میکروپلیت ریدر نیز گفته می شود،ابزارهایی هستند که در تشخیص رویدادهای زیست شناسی، شیمیایی یا فیزیکی نمونه ها در صفحه های میکروتیتر مورد استفاده قرار می‌گیرند. این دستگاه کاربرد گسترده ای در کشف دارو، اعتبارسنجی‌های زیست‌شناسی، کترل کیفیت و فرآیندهای تولید در صنایع دارویی و زیست‌فناوری دارد. فرمت‌های رایج تر میکروپلیت که در تحقیقات آکادمیک و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می‌گیرد دارای ۹۶ چاهک(ماتریس ۸ در ۱۲) است. میکروپلیت های سنگین تر(که ۳۸۴ یا ۱۵۳۶ چاهک دارند) ، عموما برای غربالگری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد وتوان را افزایش و هزینه را کاهش می‌دهد.

حالت های تشخیصی رایج دستگاه میکروپلیت ریدر شامل جذب، مشاهده فلورسانس، لومینسانس، قطبش فلوئورسانس و Time-resolved fluorescence است.

جذب

تشخیص جذب در میکروپلیت ریدرها بیش از سه دهه است که قابل دسترس است و برای اعتبارسنجی هایی نظیر الایزا، اندازه گیری پروتئین و نوکلئیک اسید یا فعالیت آنزیم استفاده می‌شود. یک منبع نور نمونه را با استفاده از طول موج خاص (انتخاب شده توسط یک قطعه نوری یا مونوکروماتور) روشن می کند و یک ردیاب نور که در طرف دیگر چاه قرار دارد ، مقدار نور عبوری از طریق نمونه را اندازه گیری می کند. مقدار نور عبور داده شده،عموما به غلطت مولکول مورد نظر مربوط است. ارزیابی آمونیوم،نیترات،نیتریت،اوره،آهن و اورتوفسفات،نمونه‌هایی از آنالیزهایی هستند که به روش میکروپلیت ریدر تبدیل شده اند.بیشتر رنگ‌سنجی های شیمیایی اخیر،به طور مستقیم برای استفاده در میکروپلیت ریدر توسعه یافته اند.

فلورسانس

تشخیص فلوئورسانس در فرمت میکروپلیت به طور گستره در دو دهه‌ی اخیر گسترش یافته است.طیف کاربردهای آن بسیار گسترده تر از استفاده از جذب است اما این ابزار غالبا گران‌تر است.در این نوع ابزار،اولین سیستم نوری،نمونه را با استفاده از طول موج خاصی روشن می‌کند.در نتیجه‌ی این روشنایی،نمونه نور ساطع می‌کند و سیستم نوری ثانویه،این نور ساطع شده را جمع‌آوری می‌کند و آن را(با استفاده از یک فیلتر یا سیستم مونوکروماتور) از نور خارجی مجزا می‌کند و این سیگنال را با استفاده از یک ردیاب نوری همانند لوله‌ی فوتومولتیپلر اندازه گیری می‌کند.از مزایای این روش نسبت به مشاهده‌ی جذب،حساسیت است؛ و دامنه‌ی کاربرد که انتخاب گسترده ای از برچسب های فلورسنتی که امروزه موجود هستند،به دست می‌دهد. به عنوان مثال،تکینیکی که تصویربرداری کلسیمی نامیده می‌شود، شدت رنگهای حساس به کلسیم را برای ارزیابی میزان کلسیم داخل سلولی اندازه گیری می کند.

لومینسانس

لومینسانس نتیجه‌ی یک واکنش شیمیایی یا زیست‌شناسی است.ردیابی لومینسانس از لحاظ نوری ساده تر از فلورسانس است؛به این دلیل که لومینسانس نیازی به یک منبع نور برای تحریک ندارد.

یک سیستم نوری لومینسانس تشکیل شده از یک محفظه‌ی خوانش نور و یک ردیاب PMT. برخی از پلیت ریدر ها یک ردیاب PMT آنالوگ را بکار می‌برند درحالیکه بقیه دستگاه‌ها،یک ردیاب شمارنده‌ی فوتون دارند. شمارنده‌ی فوتون به طور گسترده ای به عنوان حساس ترین وسیله تشخیص لومینسانس پذیرفته شده است.برخی پلیت ریدر ها چرخ های فیلتر یا سیستم های نوری سنجش طول‌موج مونوکروماتور قابل تنظیم را برای انتخاب طول‌موج‌های لومینسانس خاص را پیشنهاد می‌دهند.

قطبش فلورسانس

این تکنیک نیز بسیار شبیه به ردیابی FI است.تنها تفاوت دراین است که این سیستم شامل فیلترهای پولاریزاسیون است که در مسیر نور قرارگرفته‌اند. نمونه های داخل میکروپلیت با استفاده از نور پولاریزه(قطبیده شده) تحریک می‌شوند. بسته به تحرک مولکول‌های فلورسنتی که در چاه ها هستند، نور ساطع شده می‌تواند پولاریزه یا غیرپولاریزه باشد.برای مثال،مولکول‌های بزرگ موجود در محلول(مثل پروتئین) که به خاطر اندازه‌شان نسبتا آرام می‌چرخند، وقتی با نور پولاریزه تحریک می‌شوند، نور پولاریزه را ساطع می‌کنند.از سوی دیگر،چرخش سریع مولکول‌های کوچک‌تر،سبب دپولاریزه شدن سیگنال می‌شود.سیستم تحریک در این پلیت ریدر،فیلترهای پولاریزه رابرای بررسی پولاریزه بودن (قطبیدگی) نور ساطع شده بکار می‌برد.سطح پایین پولاریزاسیون،نشان می‌دهد که مولکول ‌های کوچک آزادانه در محلول حرکت می‌کنند.سطح بالای قطبیدگی نور ساطع شده نشان‌دهنده‌ی این است که فلورسنت به یک کمپلکس مولکولی بزرگتر متصل شده است. در نتیجه،یکی از اساسی ترین کاربردهای ردیابی FI،ارزیابی اتصال مولکولی است؛زیرا می‌توان تشخیص داد که آیا یک مولکول کوچک فلورسنت به یک مولکول بزرگتر غیرفلورسنت متصل شده یا نه؛ بدین صورت که اتصال سبب کاهش سرعت چرخش مولکول فلورسنت، و درنتیجه افزایش پولاریزاسیون می‌شود.

 

Time-resolved fluorescence

Time-resolved fluorescence  یا TRF بسیار شبیه به اندازه گیری شدت فلورسانس (FI) است.  تنها تفاوت آنها در زمان بندی فرایند تحریک / اندازه گیری است.  هنگام اندازه‌گیری FI ، فرایندهای برانگیختگی و انتشار همزمان هستند و نور ساطع شده توسط نمونه در حین تحریک اندازه گیری می شود.هرچند سیستم های انتشار در از بین بردن نور تحریک قبل از رسیدن به ردیاب بسیار کارآمد هستند،میزان نور تحریک در مقایسه با نور انتشار به گونه ای است که اندازه گیری FI همیشه سیگنال های پس زمینه نسبتاً بالایی را نشان می دهد. TRF راه حلی برای این مشکل ارائه می‌دهد که مبتنی بر استفاده از فلورسنت های خاص تحت عنوان لانتانیدها است که این خاصیت را دارند که پس از گذشت مدت طولانی از تحریک (در حدود میلی ثانیه) ، از خود نور ساطع می‌کنند؛در صورتی که بیشتر رنگ‌های فلورسنت استاندارد فقط تا چند نانوثانیه پس از برانگیخته شدن،نور منتشر می‌کنند.در نتیجه می‌توان لانتانیدها را با استفاده از یک منبع نور پالس تحریک کرد و بعد نتیجه را اندازه‌گیری کرد.در این صورت پالس‌های زمینه‌ای در مقایسه با سنجش استاندارد FI کمتر خواهد بود. .اشکالاتی که وجود دارد این است که ابزارها و معرف‌ها معمولا گران هستند و این که کاربردها باید سازگار با استفاده از رنگ‌های لانتانید خیلی خاص باشند.کاربرد اصلی TRF در غربالگری دارو،تحت عنوان TR-FRET (time-resolved fluorescence energy transfer) یافت می شود.سنجش TR-FRET بسیار مقاوم است و می‌توان به راحتی آن را در مقادیر کوچک بکار برد.استحکام،قابلیت خودکارسازی و کوچک سازی ویژگی‌های مورد توجه در آزمایشگاه غربالگریست.

پراکندگی نور و نفلومتری

پراکندگی نور و نفلومتری،روش‌هایی برای تعیین قسمت حل‌نشده‌ی یک محلول هستند.یک باریکه‌ی نور از نمونه عبور داده می‌شود و این نور توسط ذرات معلق پراکنده می‌شود.نور پراکنده‌ای که در قسمت دیگر محلول اندازه‌گیری می‌شود،نشان‌دهنده‌ی مقدار ذرات حل‌نشده‌ی موجود در محلول است.کاربردهای رایج پراکندگی نور/نفلومتری، شامل غربالگری خودکار حلالیت دارو،سینتیک رشد میکروبی طولانی مدت،لخته سازی و… است.

ابزارها و ارزیابی‌ها

بسیاری از روش های تشخیصی(جذب،فلورسنت،لومینسنس و….) بصورت مستقل در میکروپلیت های اختصاصی در دسترس هستند،اما اغلب بصورت ترکیب شده در یک دستگاه یافت می‌شوند. همچنین ابزارهایی برای اندازه‌گیری نور دینامیک و استاتیک پراکنده شده از نمونه‌ها در میکروپلیت موجودند. محدوده‌ی کاربرد میکروپلیت ریدرهای چندحالته بسیار وسیع است. برخی از رایج ترین کاربردهای این دستگاه‌ها عبارتند از:

الایزا

ارزیابی پروتئین و رشد سلولی

اینتراکشن های پروتئین-پروتئین

ارزیابی نشانگرها

کمیت نوکلئیک اسید

اینتراکشن های مولکولی

فعالیت آنزیمی

سمیت سلولی

کمیت ATP

ایمنی‌سنجی

کشف دارو

درحالیکه پلیت ریدر عموما به موارد گفته شده در بالا اشاره دارد،ابزارهای متنوع دیگری نیز در دسترسند.چند نمونه از دستگاه‌هایی که با فرمت میکروپلیت ریدر کار می‌کنند عبارتند از:

-پلیت ریدر های ELISPOT:برای شمارش لکه‌های رنگی که در دوره سنجش ELISPOT شکل می‌گیرند،استفاده می‌شوند.

– High-content screening (HSC): سیستم‌های غربالگری که هر چاه را برای ردیابی جمعیت سلولی با وضوح بالا تصویرسازی می‌کنند.

-ابزارهای بدون لیبل که از میکروپلیت‌های تخصصی برای اندازه‌گیری وقایع اتصال،بدون استفاده از نشانگر های شیمیایی استفاده می‌کنند.

 

Gel documentation system

 Gel documentationبه ابزاری گفته می‌شود که به طور گسترده در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی برای تصویرسازی و مستندسازی اسید نوکلئیک و پروتئین‌های نشاندار شده در ژل های پلی آکریلامید یا آگارز یا سلولز مورد استفاده قرار می گیرد . این ژل ها به طور معمول توسط اتیدیوم برومید یا سایر رنگ‌های اسید نوکلئیک مانند GelGreen،رنگ می شوند. سیستم ها بسته به توان و نوع نمونه ، تنظیمات متنوعی دارند. به طور کلی ، یک ژل داک شامل یک منبع نور ماوراء بنفش (UV) ، یک هود یا اتاق تاریک برای محافظت از منابع نوری خارجی و محافظت از کاربر در برابر اشعه ماوراء بنفش ، و یک دوربین CMOS برای ثبت تصویر است. ژل الکتروفورز در اتاق تاریک قرار می‌گیرد و نور (عموما فلورسانس) به ژل تابانده می‌شود؛ در نتیجه نشانگر هایی که به پروتئین یا DNA متصل شده و نسبت به نور حساسیت نشان می‌دهند،با تابش نور مرئی،پروتئین و یا DNA را بصورت رنگی نشان می‌دهند.و دوربین مخصوص عکس آن را ثبت میکند؛سپس اطلاعات مربوطه به وسیله‌ی نرم افزار های خاص قابل بررسی است.

مدلهای تصویری که اخیراً تولید شده اند همچنین شامل ویژگی هایی برای کنترل انواع فلورسانس و لومینسانس با دوربین هایی هستند که تا 60- درجه سانتیگراد خنک شده اند.  سایر ویژگی های پیشرفته عبارتند از: چاپ سریع روی دوربین و اتصال به Wi-Fi جهت کنترل توسط تلفن های هوشمند و تبلت.

کاربردها

تصویربرداری از ژل و بلات

 شمارش کلنی

 ایمنی‌سنجی

 تشخیص پروتئین

 تعیین تغییرات پس از ترجمه

 الکتروفورز دو بعدی

 کمیت پروتئین

انواع سیستم های ژل Doc

 نوع سیستم های مستندسازی ژل مورد نیاز آزمایشگاه، بستگی به روش کاربرد و تشخیص دارد.

 کِمی‌لومینسانس: به طور کلی برای وسترن بلات مورد استفاده می گیرد.

ردیاب های اتیدیوم برمید دیجیتال/CCD ، مادون قرمز ، کِمی‌لومینسانس ، فلورسانس 3 رنگ ، چگالی سنجی و نور مرئی در دسترسند تا خوانش کمی از نوارهای اسید نوکلئیک و پروتئین ، بلات های نقطه ای و میکروپلیت ها انجام گیرد.

 رادیوگرافی خودکار فیلم: برای رادیوایزوتوپ ها استفاده می شود.

 لیزر: حساسیت بالا و اندازه گیری دقیق برای رادیوایزوتوپ ها و انعطاف پذیری در انتخاب فیلترهای انتشار ؛ از جمله فیلترهای سفارشی برای رنگهایی مانند Cy.

Multiplex: چندین سیگنال فلورسنت را همزمان و در همان آزمایشات تشخیص داده و تصویر می‌کند و یا سیگنال های رادیوایزوتوپی، لومینسانس و رنگ سنجی را تشخیص می‌دهد.

Phosphoimager: حساسیت پیشرفته برای کاربردهای فلورسانس چندگانه و رادیو ایزوتوپ ها ، انعطاف در انتخاب فیلترهای انتشار ، از جمله فیلترهای سفارشی.

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی

/10 دیدگاه /توسط

Real time PCR چیست؟

سایت ویستاژن در این مطلب به بررسی Real time PCR پرداخته است.

Real time PCR

برای مشاهده‌ی روند دقیق تکثیر طی PCR، از سیستمی تحت عنوان real time PCR استفاده می‌شود.در این روش نیازی به استفاده از الکتروفورز نیست؛همچنین میزان تکثیر در هر سیکل،با دقت حتی یک مولکول قابل ردیابیست.

به این تکنیک، Quantititave PCR یا به اختصار qPCR نیز می‌گویند.

این تکنیک کاربرد گسترده و متنوعی در آزمایشگاه دارد. استفاده از آن هم در تشخیص و هم در تحقیقات پایه ای رایج است. کاربرد آن در صنعت شامل ایمنی مواد غذایی و فساد مواد غذایی و تخمیر،تشخیص ارگانیسم های اصلاح  یافته ژنتیکی و کمیت و ژنوتیپ پاتوژن های ویروسی انسانی می‌شود. Real time جهت تشخیص بیماری‌هایی که از روی نوکلئیک اسید مشخص می‌شوند،برای مثال بیماری های عفونی،سرطان و ناهنجاری های ژنتیکی بکار می‌رود. همچنین در آزمایشگاه های میکروبیولوژی ابزاری برای تشخیص بیماری های نوظهور همانند سویه های جدید آنفلوآنزا و ویروس کرونا است.

به طور کلی دو روش برای تشخیص محصولات در real time رایج است:

۱. افزودن رنگ فلوئورسنس SYBR Green به محیط واکنش؛ این رنگ به هر مولکول DNA که بصورت دو رشته ای باشد متصل می‌شود و نور فلوئورسنت از خود ساطع می‌کند. در نتیجه اختصاصی عمل نکرده و ممکن است در اثر اتصال به دایمر پرایمرها یا محصولات غیراختصاصی دیگر،سیگنال تولید کرده و گزارش دقیقی از مقدار محصولات مورد نظر ما بدست ندهد.

۲. افزودن توالی های گزارشگر هدف یا reporter probe؛ این شناساگرها که توالی TaqMan probes نیز خوانده می‌شوند،بصورت اختصاصی عمل کرده و دارای یک رنگ فلوئورسنت متصل به سر ‘۵ و یک بخش quencher (که مهارکننده‌ی رنگ است)متصل به انتهای دیگر خود هستند. توالی این اولیگونوکلئوتید به گونه‌ایست که دو سر آن با یکدیگر مکمل شده و در نتیجه‌ی هیبریدیزاسیون رشته، quencher و رنگ فلوئورسنت در مجاورت هم قرار می‌گیرند و در نتیجه سیگنالی ساطع نمی‌شود.حین انجام PCR، در نتیجه‌ی اثر اگزونوکلئازی ‘۵ به ‘۳ آنزیم Taq polymerase، اتصال بین رنگ فلوئورسنت و quencher شکسته شده و در نتیجه سیگنال آزاد می‌شود.میزان سیگنال های خروجی نشان دهنده‌ی مقدار محصول تولیدی در PCR است که توسط دستگاه خوانده شده و روی صفحه نمایشگر کامپیوتر نمایش داده می‌شود.

نمودار قابل مشاهده،تحت عنوان نمودار Amplification ،دارای سه مرحله می‌باشد:

  1. مرحله نمایی یا exponential phase که طی آن تکثیر با بازدهی بالا صورت می‌گیرد و در هر چرخه مقدار ماده ژنتیکی دو برابر می‌شود،در نتیجه سیگنال‌های قوی از دستگاه دریافت شده و نمودار به شکل نمایی صعود می‌کند.
  2.  مرحله خطی یا liner phase که بعلت مصرف شدن مقداری از اجزای واکنش، سرعت تکثیر کاهش پیدا می‌کند و شیب نمودار کمتر است.
  3. مرحله پلاتو یا plateau phase که آنزیم پلیمراز ضعیف یا تخریب شده، مواد واکنش تمام شده و در نتیجه تکثیر توقف کرده و نمودار شکل افقی به خود می‌گیرد.

RT-Real time PCR

برای بررسی بیان یک ژن،نیاز است تا مقدار mRNA موجود در سلول اندازه گیری شود، زیرا مقدار mRNA ساخته شده از روی هر ژن، ارتباط مستقیم با میزان بیان آن ژن است.از آنجا که اساس کار PCR تکثیر DNA است، جهت بررسی بیان ژن لازم است mRNA های مربوط به آن ژن را از سلول استخراج کرده و سپس با reverse transcription، DNA مکمل آن را ایجاد کنیم. این DNAها که cDNA نامیده می شوند، می‌توانند تحت فرایند PCR قرار بگیرند.به این روش،reverse transcription polymerase chain reaction یا به اختصار RT-PCR گفته می‌شود. در واقع RT-PCR نوعی از real time است که نمونه اولیه آن به جای RNA،DNA است.

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی

 

/12 دیدگاه /توسط

فرم ثبت ایده

برای ثبت ایده های خود، لطفا فرم زیر را پر کنید و به نشانی ایمیل ما ارسال کنید.

 

فرمت پروپوزال ایده خلاق تجاری.فرمت pdf

 

پروپوزال ایده خلاق تجاری.فرمت وورد

/0 دیدگاه /توسط