سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح روش کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC پرداخته است.
HPLC چیست؟
کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC
(High Performance Liquid chromatography) این روش از کروماتوگرافی مهم ترین و متداول ترین روش می باشد که برای مواد غیر فرار در زمینه های مختلف در علوم مورد استفاده قرار می گیرد، که برای جداسازی و شناسایی و اندازه گیری مقادیر کم از مواد استفاده می گردد.
اولین بار توسط دانشمندی به نام تسوت (گیاه شناس روسی) که بر روی جداسازی رنگدانه های برگ سبز تحقیق می نمود،شناخته شد.
به نتایجی که از دستگاه hplc بدست آورده می شود، کروماتوگرام می گویند.
اصطلاحات رایج که در روش کروماتوگرافی مایع استفاده می شود
فاز متحرک (mobile phase): مواد مایع یا گازی که در دستگاه در جریان می باشد و سبب حرکت و جابجایی نمونه درطول ستون می باشد.
فاز ساکن (stationary phase)
مواد جامد یا مایعی که در کروماتوگرافی است که باعث مواد روی آن عمل جداسازی و یا اکثرا جذب را انجام دهد.
زمان بازداری (Retention time)
مدت زمانی که نمونه خود را به آشکار ساز می رساند.
نمونه (sample)
مخلوطی می باشد که معمولا مایع است که برای بررسی و آنالیز و اندازه گیری به دستگاه وارد می شود.
اساس جداسازی در روش های کروماتوگرافی به این صورت است که نمونه یا محلولی علاقه بیشتری به فاز ساکن دارد زیرا با سرعت کمتری درطول ستون می تواند عبور کند یا نمونه ای تمایل شدیدتری دارد که در فاز متحرک باشد زیرا با سرعت بیشتری ازستون گذر می کند.
آموزش کار با دستگاه HPLC
اجزای دستگاه HPLC
۱.پمپ
از اصلی ترین قسمت های دستگاه hplc می باشد که پمپ ها دارای انواع مختلفی می باشد که در HPLC بیشتر از نوع پیستونی مورد استفاده قرار می شود. دو مورد از مهم ترین ویژگی های پمپ ها از یکنواخت بودن و بدون پالس بودن آنها را نام برد.
ممکن است در ستون دستگاه افت فشار ظاهر شود به همین دلیل کم بودن قطر ذرات می تواند نشان دهنده از این امر باشد. پس می توان نتیجه گرفت که از این جهت پمپ استفاده می شود که نمونه بافشار(حدود ۴۰۰مگا پاسکال) وارد سیستم شود.
یک نکته مهم درمورد پمپ ها میتوان اشاره کرد که ازقطعات ضدخوردگی استفاده می شود زیرا که باعث تزریق مایعات و حلال های خورنده به سیستم می شود.
Degasser.۲
یا گاززدا: قبل ازورود حلال به سیستم باید مطئن شد که هیچ گونه هوا یا گازهای دیگری وجود نداشته باشد که باعث به وجود آمدن پیک های اضافی و برهم زدن یا تداخل با پیک هایِ به وجود آمده از نمونه می شود.
و به زبان ساده تر می توان گفت: گاززدا وظیفه حذف هوا و‌یا گازهای اضافی را انجام می دهد و از‌وارد شدن آنها به دستگاه جلوگیری به عمل می آورند.
۳.سیستم تزریق
به دلیل وجود پمپ ها، فشار در سیستم بالا می باشد و امکان تزریق مستقیم به سیستم وجود ندارد.
سیستم تزریق شامل:یک لوپ (حلقه نمونه بردار) و بارگیری (Load) و تزریق است. در موقع تزریق، انژکتور بر روی لود قرار گرفته و هنگامی که بر روی تزریق گذاشته می شود تا نمونه تزریق به سمت ستون سوق پیدا کند.
میزان تزریق در HPLC باید کمتر از کروماتوگرافی گازی (GC) باشد که حدودا ۵ تا ۵۰۰ ماکرو لیتر می باشد.
۴.ستون
از مهم ترین بخش های سیستم HPLC است به دلیل اینکه جداسازی نمونه در مواقع عبور در داخل ستون انجام می پذیرد.
۵.آشکار ساز
وقتی می خواهیم یک آشکارساز مناسب انتخاب کنیم باید منجر به بهتر شدن انتخاب پذیری و حساسیت فاز ساکن شود.
آشکارسازها انواع مختلفی دارد و بسته به شرایطشون در کروماتوگرافی مایع HPLC مورد استفاده قرار می گیرند که شامل
آشکار ساز یا دکتور طیف سنجی جرمی
براساس وزن مولکولی می باشد و اغلب برای ترکیبات پایدار حرارتی قطبی که وزن مولکولی بالا دارد مورد استفاده قرار می گیرد.
آشکار ساز هدایت الکتریکی
این آشکارساز یا دکتور درکروماتوگرافی یونی کاربرد دارد. و برای محلول های حاوی مواد یونی یا محلول های یونی استفاده می شود.
آشکار ساز چرخش نوری
این دکتور برای اندازه گیری یا مقیاس ترکیباتی که دارای ایزومر نوری هستند کاربرد دارد و توانایی جداسازی ایزومرهای نوری R و L را انجام می دهند.
آشکارساز رزونانس مغناطیس هسته
این روش حساسیت پایینی دارد به همین دلیل مزیت های فراوانی رادر خود جای داده است که متصل شدن روش های جداسازی کروماتوگرافی با NMR باعث شده که روشی قدرتمند و سریع برای جداسازی و درست کردن ساختار ترکیبات مجهول و محلول ها باشد.
گردآورنده: سرکار خانم پریناز زارع