سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش کروماتوگرافی پرداخته است.

کروماتوگرافی چیست؟

کروماتوگرافی تکنیکی است که در آزمایشگاه جهت تفکیک اجزای یک ترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ترکیب در یک فاز مایع حل می‌شود که توسط فاز دیگری به نام فاز ثابت نگه داشته می‌شود.اجزای مختلف مخلوط با سرعت‌های متفاوت حرکت می‌کنند و این عمل موجب جدا شدن آن‌ها از یکدیگر می‌شود.اساس این تفکیک بر جذب و توزیع مواد بین فاز متحرک و فاز ساکن استوار است.فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع و فاز متحرک می‌تواند مایع یا گاز باشد.

 تاریخچه کروماتوگرافی

کروماتوگرافی برای اولین بار در سال ۱۹۰۳ توسط دانشمندی روسی به نام میخائیل تسوت (Mikhail Tswett) به کار گرفته شد.این دانشمند در دهه‌ی اول قرن بیستم،بر روی جداسازی رنگدانه‌های گیاهی از قبیل کلروفیل،کاروتن و گزانتوفیل کار می‌کرد.به دلیل این که این ترکیبات دارای رنگ‌های مختلف هستند،این تکنیک “کروماتوگرافی” نام گرفت.انواع جدیدتر کروماتوگرافی که  بین دهه های ۱۹۳۰ و ۱۹۴۰ اختراع شدند،امکان استفاده از این روش را جهت جداسازی سایر ترکیبات نیز،فراهم کردند.

طی دهه‌های ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰، کروماتوگرافی در نتیجه‌ی کار مارتین (Archer john Porter Martin) وسینج (Richard Laurence Millington Synge) بطور چشمگیری توسعه یافت.آن‌ها اصول و تکنیک‌های پایه‌ای کروماتوگرافی پروتئین را بنیان نهادند و تلاش آنان سبب توسعه‌ی سریع چندین روش کروماتوگرافی شد:کروماتوگرافی کاغذی،کروماتوگرافی گازی و روشی که کروماتوگرافی گاز-مایع(HOLC) نام گرفت. از آن زمان ، این فناوری به سرعت پیشرفت کرده است.محققان دریافتند که اصول اصلی کروماتوگرافی تسوت می تواند به روش های مختلفی اعمال شود و در نتیجه انواع مختلف کروماتوگرافی اختراع و بکار گرفته شد.  پیشرفت‌های مداوم، باعث بهبود عملکرد فنی کروماتوگرافی شدند.

انواع کروماتوگرافی

بر اساس حالت فیزیکی فاز ساکن و فاز متحرک،کروماتوگرافی به انواع زیر تقسیم می‌شود:

• کروماتوگرافی جامد-مایع

   ژلی

  تبادل یونی

   کاغذی

   لایه نازک

• کروماتوگرافی جامد-گاز

• کروماتوگرافی مایع-مایع

   کاغذی

   تقسیمی

• کروماتوگرافی مایع-گاز

همچنین می‌توان کروماتوگرافی را از لحاظ شکل بستر به انواع زیر تقسیم کرد:

• ستونی

کروماتوگرافی ستونی روشی از جداسازیست که فاز ساکن داخل یک لوله قرار دارد.فاز ساکن جامد،با یک مایع پوشیده شده است که ممکن است همه‌ی فضای لوله را اشغال کند یا در امتداد دیواره‌ی درونی لوله متمرکز شود و فضایی در قسمت میانی لوله برای عبور فاز متحرک ایجاد شود.پس از جریان یافتن حلال در داخل ستون،فاز مایع نمونه را به سمت پایین لوله انتقال می‌دهد ولی چون فاز جامد ترکیبات مختلف موجود در نمونه را با قدرت یکسانی جذب نمی‌کند،برخی ترکیبات سریع‌تر داخل ستون حرکت می‌کنند.

فاز جامد این نوع کروماتوگرافی از جنس موادی همچون آلومین،سیلیکاژل،فلورسین،منیزیم اکسید،کربنات کلیسم و…می باشد.

در سال ۱۹۷۸ کلارک استیل نسخه‌ی جدیدی از کروماتوگرافی ستونی را تحت عنوان کروماتوگرافی ستونی فلش اختراع کرد.در این تکنیک،حلال تحت تاثیر یک فشار اضافی خارجی درون ستون حرکت می‌کند؛این حالت سبب می‌شود مدت زمان کروماتوگرافی کاهش یافته و در حدود ۲۰ دقیقه،جداسازی اجزا انجام شود.

• مسطح

کروماتوگرافی کاغذی: در این تکنیک محلول روی نقطه ای از کاغذ کروماتوگرافی گذاشته می‌شود.کاغذ درون ظرف حاوی مایع حلال قرار می‌گیرد و سپس حلال از طریق کاغذ،بالا می‌آید.کاغذ کروماتوگرافی از جنس سلولز و قطبیست و ترکیبات موجود در نمونه هرچه قطبیت کمتری داشته باشند بالاتر می‌روند.ترکیبات قطبی‌تر سریعتر با کاغذ تشکیل پیوند می‌دهند و در نتیجه مسافت زیادی را طی نمی‌کنند.

کروماتوگرافی لایه نازک:این روش از نوع کروماتوگرافی جامد-مایع است.در این نوع کروماتوگرافی یک قطره از از نمونه روی لایه‌ی جاذب که روی سطح جسمی بی اثر مانند شیشه پخش شده،گذاشته می‌شود.سپس لایه‌ی جامد درون ظرفی حاوی مایع استخراج کننده قرار می‌گیرد.(سطح مایع پایین‌تر از لکه‌ی نمونه است.)حلال توسط لایه جاذب به آرامی به سمت بالا کشیده می‌شود و در نتیجه هر یک از اجزای نمونه بسته به ویژگی هایشان در محلی خاص از لایه تجمع پیدا می‌کنند و در نهایت بطورت لکه‌ دیده می‌شوند.فاز ساکنِ کروماتوگرافی لایه نازک معمولا از جنس سلولز، سیلیکاژل یا آلومین است.

شرح برخی از انواع کروماتوگرافی،بر اساس حالتِ فاز متحرک،بصورت زیر است:

کروماتوگرافی‌های گازی:

• کروماتوگرافی گاز-جامد(GSC): اساس این تفکیک،جذب سطحی گاز روی سطح جامد است.
• کروماتوگرافی گاز-مایع(GLC):کروماتوگرافی گازی معمولا داخل ستونی انجام می‌شود که ممکن است ستونِ packed یا ستون مویین  باشد.ستون‌های packed،ارزان‌تر بوده و استفاده از آنها راحت تر است.ستون های مویین هرچند گران‌ترند اما دارای وضوح بهتری بوده و برای ترکیبات پیچیده تر مورد استفاده قرار می‌گیرند.هر دو نوع ستون از مواد شیمیایی بی اثر و جاذب تشکیل شده اند.

کروماتوگرافی گازی بر تعادل تقسیم آنالیت بین یک فاز ساکن مایع (اغلب سیلیکون مایع) و یک فاز متحرک گازی(اغلب هلیوم) مبتنی‌ست.فاز ساکن داخل یک شیشه با قطر کوچک(ستون مویین) و یا یک ماتریکس جامد در یک لوله‌ی بزرگتر(packed) ریخته می‌شود.این تکنیک برای آنالیزهای شیمیایی پرکاربرد است.هرچند دمای بالای مورد استفاده در آن،باعث واسرشتگی مولکول‌های زیستی از قبیل پروتئین ها می‌شود،اما جهت استفاده در تحقیقات بیوشیمی،در پتروشیمی،نظارت و اصلاحات محیط زیستی و شیمی صنعتی مناسب است.

کروماتوگرافی‌های مایع:

• کروماتوگرافی مایع-مایع: این تکنیک بطور کلی از لحاظ قطبیت به دو نوع تقسیم می‌شود.روش‌هایی که در آن‌ها فاز ساکن قطبی‌تر از فاز متحرک است کروماتوگرافی فاز مایع نرمال نامیده می‌شود و حالت عکس آن،کروماتوگرافی فاز مایع معکوس نام دارد.

 کروماتوگرافی‌های کاغذی و تقسیمی از این نوع کروماتوگرافی هستند.

کروماتوگرافی تقسیمی: در این تکنیک،اساس تقکیک قدرت انحلال پذیری اجزا در فاز ساکن است.اجزایی که با سرعت بیشتری حل می‌شوند، سریع‌تر در طول ستون حرکت خواهند کرد.این روش شبیه به کروماتوگرافی ستونی جذب سطحیست با این تفاوت که معمولا ظرف مورد استفاده در این تکنیک کوچکتر است و همچنین فاز مایع موجود در ستون نیز متفاوت است.

• کروماتوگرافی مایع-جامد: به انواع جذب سطی،ژلی،تبادل یونی و لایه کاغذی تقسیم می‌شود.

کروماتوگرافی ژلی:در این تکنیک از یک ژل پایدار و بی اثر استفاده می‌شود که دارای تخلخل‌هایی با اندازه های متفاوت است.در نتیجه اجزای نمونه بر حسب جرم مولکولی،به ترتیب از ستون خارج می‌شوند؛اگر نمونه شامل مولکول‌هایی با انداز‌ه‌ی بسیار بزرگ باشد،اصلا وارد ژل نشده و در نتیجه تفکیک نمی‌شوند.همچنین اگر اجزای خیلی ریز در مخلوط موجود باشد،در ژل فرورفته و از هم جدا نخواهند شد.

بیشترین کاربرد این نوع الکتروفورز در تفکیک ماکرومولکول های زیستی همچون پروتئین،آنزیم،اسید نوکلئیک و پلی ساکاریدهاست.همچنین جهت جداسازی درشت مولکول های مصنوعی نیز بکار می‌رود.

ویستاژن   ویستا ژن vistagene

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی