نوشته‌ها

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح باکتری E.coli و کاربردهای آن پرداخته است.

معرفی باکتری E.coli

در این پژوهش قرار است، درمورد یکی از انواع باکتری ها بنام باکتری اشریشیا کلی که در عرصه و حوزه آنتی بیوتیک و علم زیست شناسی کاربرد فراوان دارد، صحبت کنیم:

اول از همه بپردازیم به شناخت باکتری اشریشیاکلای که به عبارتی به اسم E.coli هم معروف می باشد. بنام باکتری اشریشیاکلی از خانواده انتروباکتریاسه که جز بزرگترین و نامتجانس ترین مجموعه که نوعی باسیل گرم منفی است و به صورت شایع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. اغلب سویه های باکتری اشریشیاکلای، بی آزار می باشند اما برخی از آنها باعث مسمویت غذایی و اسهال می شود مانند: O157: H7

اغلب این سویه های بی آزار، قسمتی از فلور روده را می سازند که در تولید ویتامین K2 نقش به سزایی دارد و همچنین مانع استقرار باکتری های بیماری زا در روده می شود که به عبارتی از لحاظ بالینی اهمیت ویژه ای دارد.

از مثالهایی که میتوان گفت درمورد این باکتری این است که باعث بوجود آمدن بیماری و عفونت مجاری ادراری می شود که پس از این بیماری عفونت ریوی هم در این خصوص شایع می باشد. علت آن هم باکتری های گرم منفی که در گروه باکتری اشریشیاکلای است، می باشد. عوامل زیادی در بیماری زایی این باکتری نقش ایفا می کنند.

بطور کلی صفات انتروباکتریاسه ها عبارتند از: باسیل گرم منفی، هوازی ـ بیهوازی اختیاری، تخمیر گلوکز به اکسید، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی و در آخر شامل انواع متحرک فلاژل پریش می باشند.

انواع گونه های اشریشیاکلی

باکتری اشریشیاکلی جز فراوان ترین موجود بی هوازی اختیاری می باشد که در کلون و مدفوع نیز وجود دارد و دارای 5 گونه می باشد که جز پر اهمیت ترین گونه ها هستند و سویه هایی از این باکتری که سبب گاستروانتریت می شوند به 6 گروه تقسیم می شوند که عبارتند از :

Entro toxigenic Ecoli(ETEC)

Entro phatogenic Ecoli(EPEC)

Entro invisive Ecoli(EIEC)

Entro hemoragic Ecoli (EHEC)

Entro aggregative Ecoli(EAEC)

Diffuserly adherent Ecoli(EDEC)

لازم بذکر است باکتری اشریشیا کلی انتروهموراژیک عامل اسهال های ناشی از مواد غذایی در کشورهای پیشرفته شده است که تولید کننده شیگاتوکسین است و همچنین باعث بوجود آمدن کولیت هموراژیک و سندرم همولیتیک اورمیک در انسان می شود.

همانطور که پیشتر صحبت کردیم درمورد؛O157: H7 که مهم ترین سروتایپ شایع می باشد که سبب اپیدمی و همچنان باعث مرگ و میر می شود. 

این نوع اشریشیاکلی سبب اسهال خونی که همراه با درد شکمی و به ندرت با تب گزارش شده است. این بیماری بیشتر در کودکان زیر 5 سال مشاهده شده است. راههای انتقالی که این بیماری را ایجاد می کند شامل؛ مصرف گوشت قرمز یا محصولات گوشتی با پخت ناکافی، شیر، میوه ها، تماس فرد به فرد، سبزیجات پخته نشده، آب آلوده و شناکردن در آب آلوده می باشد.

این نوع اشریشیاکلی یک پاتوژن مهم انسان و حیوان می باشد که بعد از اتصال به سلولهای میزبان اولین گام در ثابت کردن باکتری راب به وسیله سیستم ترشحی و از طریق ارتباطهای بین پروتئین های ترشحی انجام می گردد.

تست های تشخیصی که برای اشریشیاکلی

در روز اول: کشت نمونه مدفوع برروی محیط مک کانکی قرار میگیرد که روی این محیط کلنی های بیرنگ ایجاد می کنند و در روز دوم: کشت روی محیط های افتراقی (لاکتوز مثبت، ایندول مثبت، سیترات منفی) قرار گرفته می شود.

و هم چنین قابل ذکر است،تست های بیوشیمیایی هم وجود دارد، برای بررسی آزمایشگاهی اشریشیاکلی که عبارتند از:

سیترات حرکت تولید گاز از گلوگز ایندول تخمیر لاکتوز باکتری
ـ + + + + E.coli
ـ ـ ـ ـ ـ E.coli inactive

برخی دیگر از مواد و روشی که در ارتباط با باکتری اشریشیاکلی است شامل موارد زیر می باشد:

1.نمونه برداری و آزمون های بیوشیمیایی و میکروبی که درموردش مقداری صحبت شد، که به منظور جدا نمودن باکتری اشریشیاکلی از سایر باسیل های گرم منفی و انتروباکتریاسه از محیطهای بیوشیمیایی و افتراقی می شود. 2. استخراج دی ان ای و تعیین کیفیت و کمیت آن که دراین مرحله اصولا محیط کشت سانتریفیوژ می شود و بعد از دوبار شستشو با آب مقطر استریل و ورتکس می شود که باز مجدد درون سانتریفیوژ گذاشته می شود و همچنان در مرحله اخر ژل الکتروفورژ با استفاده از دستگاه پی سی آر که بعد از استخراج دی ان ای این کار صورت می گیرد و با ژل الکتروفورژ رنگ آمیزی آن آشکار شده است.

کشفی جدید درمورد اشریشیاکلی

درسال 2019 محققان ترکیبی از بین برند باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک کشف کردند به این زیر شرح زیر گزارش شده است:

محققان دانشگاه شیفلد ترکیبی جدید کشف کردند که باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک را از بین می برد. این تیم تحقیقاتی به سرپرستی پروفسور جیم توماس در حال تست یک ماده جدید برروی باکتری های گرم منفی مقاوم به آنتی بیوتیک از جمله باکتری اشریشیاکلی بیماری زا می باشد.

باکتری های گرم منفی مانند اشریشیاکلی می توانند سبب عفونت های مجاری ادراری و عفونت های خونی شوند. درمان این بیماری ها به این دلیل است که دیواره سلولی باکتری مانع از ورود دارو به داخل میکروب می شود، که بسیار سخت می باشد.

مقاومت ضدمیکروبی هم اکنون مسئول مرگ سالانه 25000 نفر در اتحادیه اروپا است؛ اگر این تهدید به سرعت بررسی نشود، ممکن است تا سال 2050 بیش از 10 میلیون نفر سالانه به علت عفونت های مقاوم به آنتی بیوتیک جان خود را از دست می دهند. پزشکان در طی 50 سال اخیر درمان جدیدی برای باکتریهای اشریشیاکلی یا همان باکتری های گرم منفی پیدا نکرده بودند و لازم به ذکر است که هیچ داروی بالقوه ای تا سال 2010 وارد آزمایش های بالینی نشده بود اما درچند دهه اخیر تحقیقات نشان داده اند که به نظر می رسد این ترکیب چندین روش عمل داشته که سبب بروز مقاومت آنتی بیوتیکی در برابر باکتریها می باشد و آنهارا کاهش می دهند. دانشمندان دانشگاه شیفلد معتقدند: این پیشرفت میتواند باعث درمان های حیاتی نوینی برای باکتری ها خطر ساز و نیز باعث کاهش خطر درحال رشد مقاومت ضدمیکروبی باشد.

کشف درمان های جدید برای این نوع باکتری ها در اولویت می باشد، زیرا این باکتری ها همچنام که میدانیم و گفته شد سبب ایجاد عفونت با میزان مرگ و میر بالا می شوند و به سرعت در حال مقاوم شدم می باشند و درمان هایی موجود است که اغلب از بیمارستانها شیوع پیدا کرده است.

باکتری اشریشیا کلی هرسال مسئول میلیون ها عفونت ضدآنتی بیوتیکی درجهان میباشد که به سبب این ترکیب از نابود می شود.

 

گردآورنده: سرکار خانم پریناز زارع

سایت ویستاژن ویدیویی از روش PCR در این پست قرار داده. اگر سوالی در مورد این روش دارید،در کامنت ها قرار دهید تا توسط کارشناسان ما پاسخ داده شود.  

واکنش زنجیرهٔ پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن PCR می باشد، به طور کلی به روش ازدیاد مقادیر جزئی DNA یا RNA به تعداد هزار یا میلیون‌ها نسخه روش های آزمایشگاهی اطلاق می شود. از کاربردهای پی سی آر می توان به کاربرد آن در بررسی حذفهای کروموزومی مشخص، تکثیر DNA برای تعیین توالی، تشخیص بیماری های وراثتی اشاره کرد.

 

 

ویستاژن ویستا ژن ویستا ژن ویستا ژن vistagene vistagene vista gene vista gene

کاربردهای کلونینگ ژن ها در پزشکی

یکی از مهم ترین فواید انقلاب DNA نوترکیب، جنبه های بالینی آن بوده و خواهد بود. در این مقاله سایت ویستاژن به بررسی این کاربردها پرداخته است.

 

  1. تولید داروهای نوترکیب

  • انسولین نوترکیب
  • سنتز هورمون رشد انسانی در E.coli
  • فاکتور VIII نوترکیب
  • ساخت دیگر پروتئین های انسانی نوترکیب
  • واکسن های نوترکیبپ

2. تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

3. ژن درمانی

تولید داروهای نوترکیب

برخی از بیماری های انسان به دلیل فقدان پروتئین ها یا عملکرد نامناسب آن ها در بدن بوجود می آیند. بسیاری از این بیماری ها ر می توان با تجویز پروتئین مناسب درمان کرد. اما برای این کار در مرحله اول پروتئین مورد نظر باید در مقدیر بالا وجود داشته باشد. اگر پروتئین مورد نظر انسانی باشد،بدست آوردن مقادیر مناسب مشکل بزرگی محسوب می شود مگر اینکه بتوان آن را از خون استخراج کرد.

پروتئین های جیوانی اگر کارایی لازم را برای درمان بیماری های انسانی داشته باشند،مورد استفاد قرار می گیرند.اما بیماری هایی که قابل درمان با پروتئین هی حیوانی باشند،زیاد نیستند و در اغلب موارد احتمال پیدایش عوارضی مثل پاسخ خای حساسیتی وجود دارد.

 تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

دومین زمینه اصلی کاربرد کلون سازی ژن ها در تحقیقات پزشکی،شناسایی و جداسازی ژن های مسئول بیماری های انسانی است.

یک بیماری ژنتیکی یا ارثی بیماری است که در اثر نقص یک ژن خاص ایجاد می شود.افرادی که حامل ژن معیوب هستند در مرحله ای از طول حیات خود بیماری را تجربه می کنند. در مورد برخی از بیماری های ارثی مثل هموفیلی، ژن روی کروموزوم X قرار داد، بنابراین تمام مردانی که ژن معیوب دارند،بیماری را بروز می دهند و زنانی که یک ژن معیوب و یک سالم دارند،سالم خواهند ماند.اما ممکن است بیماری را به پسران خود انقال دهند.

ژن های بیماری های دیگر روی کروموزوم اتوزومی قرار دارند و در بیشتر موارد مغلوب هستند،بنابراین وجود نقص در هر کروموزوم، لازمه بروز بیماری است.تعدا کمی از بیماری ها مثل هانتینگتون، با وجودی که توزومی هستند، غالب می باشند و حتی وجود یک نسخه از ژن معیوب برای ایجاد بیماری کافی است.

اهمیت شناسایی ژن مسئول در بروز بیماری های ژنتیکی

  • با شناسی ژن ممکن است اساس بیوشیمیایی بیماری حاصل شود و به این ترتیب امکان طرای روش درمان پدید آید.
  • از شناسایی جهش های موجود در ژن معیوب می توان برای انجام برنامه های غربالگری استفاده کرد و به این ترتیب افراد حامل یا کسانی که هنوز بیماری در آنها پیشرفت نکرده است را شناسایی کرد.
  • شناسایی ژن، یک پیش نیاز برای ژن درمامی است.

ژن درمانی

ژن درمانی به روشی اطلاق می شود ک هدف آن درمان یک بیماری ارثی با انتقال نسخه صحیحی از ژن معیوب به فرد بیمار است. ژن درمانی در حال حاضر گسترش زیادی پیدا کرده است و  شامل تلاش هایی است که برای درمان بیماری، یک ژن کلون شده را به بیمار وارد می کنند.

رفرنس:کتاب کلون سازی ژن ها نوشته پروفسور براون

vistagene  vistagene   vistagene    vistagene کلویننگ 

سایت ویساژن در این مقاله به توضیح روش کلونینگ پرداخته است. در صورت داشتن سوال پیرامون این روش، آن را در سایت ثبت نموده تا توسط کارشناسان ما پاسخ داده شود.

کلونینگ چیست؟

کلونینگ به تولید کپی های یکسان از ارگانیسم ها، سلول ها یا توالی های نوکلئویک اسید می گویند. این فرایند با دستکاری و تداخل انسان صورت می پذیرد.

نکته: توالی های  DNA انسانی که در طی رشد طبیعی تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب نمی شوند ولی توالی هایی که به وسیله ی  PCR  تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب می شوند.

 

کلونینگ

مراحل Gene cloning

1 – جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از بقیه قطعات DNA

2 – گزینش وکتور مناسب

3 – اینتگره و متصل کردن ژن با وکتور و ایجاد پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – منتقل کردن پلاسمید به میزبان  ( Transformation or Translection)

5 – تکثیر و زیاد کردن پلاسمید (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 – انجام رونویسی (Transcription  )

7 – ترجمه و ساخت  پروتئین (Translation )

خلاصه مراحل کار

برای کلون کردن محصول PCR که درون وکتور مناسب قرار گرفته است، به همراه وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر یکسان برش داده می شود و با یکدیگر مخلوط می گردند و توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل می شوند. در مرحله بعد این مولکول DNA نوترکیب طی روندی به نام ترانسفورماسیون به درون سلول میزبان انتقال می یابد.

جداسازی محصول PCR

در ژل آگارز قطعات DNA بر اساس وزن از هم جدا می شوند. در نتیجه باند محصول PCR از ژل جدا و خالص می شود.

مواد مورد استفاده

  • ایزوپروپانل
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer

روش کار جداسازی ژن

  • باند مورد نظر توسط اسکالپل از ژل جدا می شود. بهتر است تا حد ممکن کمترین میزان ژل به همراه باند جدا شود.
  • سپس 300 میکرو لیتر Binding Buffer  به آن اضافه می شود.
  • ژل آگارز به همراه بافر برای مدت 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار می گیرد تا ژل به خوبی حل شود.
  • 150 میکرولیتر ایزوپروپانول به آن اضافه می شود.
  • نمونه به خوبی ورتکس شده، کل نمونه به یک Filter tube که درون یک Collection tube  قرار دارد منتقل می شود. و در 13200 rpm  برای یک دقیقه سانتریوفیوژ می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 500 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 200 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • Filter tube درون یک تیوپ اپندروف استریل قرار گرفته و µl 50 محلول Elution   به آن اضافه می شود. پس از سانتریوفوژ نمونه در 13200 rpm  برای مدت 1 دقیقه  درون تیوپ انتقال می یابد.
  • برای ارزیابی کیفیت و غلظت DNA تخلیص شده 5 µl از نمونه در ژل آگارز 1 درصد ران می شود.

لایگیشن

  • لایگیشن مقدمه ای برای مرحله بعد یعنی ترانسفورماسیون می باشد جهت تکثیر قطعه هدف به مقدار زیاد، این قطعه باید در وکتور مناسب وارد شده و سپس همراه با وکتور وارد یک سلول میزبان شود.
  • آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین دو نوکلئوتید مجاور می شود. از نکات بسیار مهم در این واکنش غلظت نمونه DNA  هدف می باشد که برای موفقیت واکنش بسیار مهم است.

مواد مورد استفاده

  • پلاسمید  3 µl
  • DNA تخلیص شده 16 µl
  • Ligation buffer 3 µl
  • آنزیم 1 µl
  • PEG 3 µl
  • آب مقطر 1 µl

روش کار

  • در یک تیوپ اپندروف cc5 مواد زیر با یکدیگر مخلوط شده و سپس برای مدت یک شب در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

تهیه سلول مستعد جهت ترانسفورماسیون

  • جهت انجام ترانسفورماسیون سلول مستعد مورد نیاز است که پلاسمید نوترکیب به درون آن انتقال یابد.

مواد مورد استفاده

  • باکتری
  • محلول CaCl2
  • محلول CaCl2-MgCl2
  • DMSO
  • محیط کشت

روش کار

  • ابتدا باکتری را در محیط  کشت داده و در انکوباتور 37 ساعت انکوبه می شود.
  • یک کلونی از باکتری را در 100 میلی لیتر محیط مایع کشت داده و در شیکرانکوباتور انکوبه کرده و پس از رسیدن به فاز لگاریتمی رشد انکوباسیون متوقف گردید.
  • محیط کشت به لوله 50 میلی لیتری انتقال می یابد( این لوله قبلا درون یخ قرار گرفته) و برای مدت 10 دقیقه درون یخ قرار می گیرد.
  • سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجهء سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

محیط روی سلول ها خارج و به رسوب حاصل , 30 میلی لیتر محلول CaCl2-MgCl2 سرد استریل اضافه شد.

سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

به رسوب باکتری 2 میلی لیتر محلول صفر درجه CaCl2 اضافه شد و سوسپانسیون سلولی تهیه شد.

به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد و به آرامی مخلوط گشت. و سپس به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد.

مجددا به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه و سلول ها تقسیم و در 70- درجهء سانتیگراد نگهداری شد.

ترانسفورماسیون

  • با استفاده از روش شوک حرارتی در لحظات کوتاهی منافذی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان ایجاد کرده تا DNA نوترکیب وارد سلول شود. DNA حاصل از مرحله لایگیشن  جهت ترانسفورماسیون در سلول های مستعد مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین 100 µg/ml
  • IPTG
  • X-Gal
  • محصول لایگیشن ( پلاسمید نوترکیب)
  • سلول مستعد

روش کار

  • سلول های مستعد از دمای 70- درجه سانتیگراد خارج و در مجاورت یخ قرار داده می شوند تا به آرامی ذوب شوند.
  • تیوپ های اپندروف قبل از استفاده در یخ قرار می گیرند و سپس 20 میکرولیتر از سلول های مستعد به آنها اضافه شد.
  • 1 میکرولیتر از محصول لایگیشن به آرامی با سلول ها مخلوط و به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شد.
  • تیوپ های اپندروف حاوی سلول و پلاسمید جهت شوک حرارتی , به مدت 30 ثانیه در دمای 42 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • تیوپ های اپندروف برای مدت 2 دقیقه در یخ قرار داده شد.
  • 80 میکرولیتر محیط کشت مایع بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
  • سپس این باکتری ها روی پلیت های حاوی آمپی سیلن( 100, X-Gal و IPTG کشت داده شد و در دمای 37 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • در ترانسفورماسیون سلول ها , استفاده از کنترل جهت ارزیابی کارایی ترانسفورماسیون و سلول ها و ممانعت از آلودگی , ضروری است

غربالگری

  • برای غربال نمودن کلنی های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده از آنتی بیوتیکی که ژن مقاومت به آن توسط وکتور نوترکیب حمل می گردد استفاده می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین
  • IPTG
  • X-Gal
  • پلیت های حاوی باکتری ترانسفورم شده

روش کار

  • ابتدا پلیت حاوی محیط کشت را به مدت 20 دقیقه زیر هود قرار داده تا به دمای محیط برسد. ( به این محیط کشت قبلا آمپی سیلین اضافه شده است) .
  • 40 میکرولیتر IPTG و 40 میکرولیتر X-Gal به سطح محیط کشت اضافه کرده و با غلطک شیشه ای پخش می شود و کمی فرصت داده می شود تا این مواد جذب محیط کشت شود.
  • با یک لوپ استریل از کلنی های سفید که به صورت تک می باشد برداشته و روی پلیت جدید کشت داده می شود. این کار برای اطمینان یافتن از صحت ترانسفورماسیون در کلنی های مورد نظر می باشد.
  • سپس پلیت ها به مدت یک شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند.
  • IPTG شناسایی پروموتور ویژه ژن Lac Z در فرادست ناحیه 5´ ژن و القاء رونویسی آن و تولید آنزیم بتا گالاکتوزیداز را بر عهده دارد. سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و آنزیم بتا گالاکتوزیداز را تولید کنند حاوی وکتور نرمال می باشند. اما سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و به دلیل وارد شدن قطعه DNA هدف این ژن قادر نباشند آنزیم فوق را تولید کنند حاوی وکتور نوترکیب می باشند.
  • X-GaL به عنوان سوبسترا برای بتا گالاکتوزیداز محسوب شده و بعد از تجزیه توسط این آنزیم ماده ای به رنگ آبی تیره در اطراف سلول های حاوی ژن فعال بر جای می ماند.وکتور نوترکیب به دلیل عدم آنزیم فوق نمی تواند X-Gal را تجزیه نماید در نتیجه کلنی های تشکیل شده سفید می باشند.

استخراج پلاسمید

روش لیز قلیایی به همراه دترجنت SDS بیش از 20 سال است که برای جداسازی پلاسمید از باکتری E.Coli  مورد استفاده قرار می گیرد. اگر سوسپانسیون باکتریایی با دترجنت های غیر یونی قوی در  pH بالا مجاور شود. دیواره باکتری تخریب کروموزوم و پروتئین های باکتریایی دناتوره و پلاسمید در محیط آزاد می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط LB Broth حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین
  • Suspension Buffer
  • RNase A
  • Lysis Buffer
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer
  • High pure filter tubes
  • Collection tube

روش کار

  • باکتری در محیط حاوی آمپی سیلین کشت داده می شود تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر به 5/1 تا 5 برسد.
  • 4-5/0 میلی لیتر از محیط سانتریوفوژ می شود تا سلول ها جدا شوند.
  • سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از محلول susprnsion buffer RNase تهیه می شود.
  • 250 میکرولیتر Lysis Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.
  • 350 میکرولیتر Binding Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در روی یخ انکوبه می شود
  • نمونه به مدت 10 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • محلول رویی به درون یک فیلتر تیوپ منتقل شده و 30 ثانیه تا 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • فیلتر توسط 700 میکرولیتر Wash Buffer شسته و فیلتر تیوپ به مدت 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • مایع تجمع یافته خارج شده , و 50 میکرولیتر Elution Buffer  یا   آب به آن اضافه می شود.
  • نمونه به مدت 1 دقیقه در 13200 rpm ساتریوفوژ شده و محصول انتهایی DNA پلاسمیدی تخلیص شده می باشد.

 

vistagene   vistagene   vistsgene   vistagene  vistagene   ویستاژن ویستاژن ویستا ژن  ویستا ژن  ویستا ژن

استفاده از مطالب سایت ویستاژن تنها با ذکر نام و لینک سایت و با هماهنگی با مدیریت  امکان پذیر می باشد.