نوشته‌ها

SDS PAGE و پروتکل ساخت ژل آن

,

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش SDS PAGE و SDS-PAGE protocol پرداخته است.

SDS PAGE چیست؟

یکی از روش‌های بررسی بیان پروتئین، استفاده از روش الکتروفورز پروتئین می‌باشد. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید جهت تعیین وزن مولکول پروتئین‌ها، روشی رایج و مهم در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی می‌باشد. این روش ضمن ساده بودن به مقدار کمی نمونه برای انجام آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تفکیک مناسب برای شناسایی و تعیین خلوص پروتئین‌هاست. در این مقاله به توضیح الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE (الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات) پرداخته شده است. ژل SDS-PAGE در یک الکتروفورز، در دو قسمت ژل جداکننده [1] و متراکم کننده[2] اجرا می‌شود. ژل متراکم کننده با آکریل آمید 5% در بالای ژل جداکننده (پس از انجماد) قرار می‌گیرد و شانه در ژل متراکم کننده قرار می‌گیرد.

طرز تهیه ژل پلی آکریلامید

جدول 1) درصد آکریل آماید مورد استفاده نسبت به وزن مولکولی پروتئین

محدوده وزن مولکولی درصد آکریل آماید
50 kDa – 500 kDa 7%
20 kDa – 300 kDa 10%
10 kDa – 200 kDa 12%
3 kDa – 100 kDa 15%
  • درصد آکریل آماید ژل به سایز نمونه پروتئین بستگی دارد (جزئیات در جدول 1 نشان داده‌شده است)
  • حجم ژل متراکم کننده و جدا کننده بر حسب ضخامت کاست متفاوت است (جدول 2).

 

SDS-PAGE

 

طرز تهیه ژل پلی آکریلامید

جدول 2 حجم ژل متراکم کننده و جداکننده بر حسب ضخامت کاست

 

 

 حجم ژل متراکم کننده ضخامت ژل
4ml 2ml 0.75mm
6ml 3ml 1.0mm
8ml 4ml 1.5mm
  • برای تهیه ml ۵ ژل متراکم کننده مقادیر به شرح جدول 3 می‌باشد.

جدول 3) مقادیر لازم برای تهیه ۵ میلی‌لیتر ژل متراکم کننده

2.975 ml H2O
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml
10% (w/v) SDS 0.05 ml
Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 0.67 ml
10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 0.05 ml
                                                                                          TEMED 0.005 ml

 

  • برای تهیه ml ۱۰ ژل جداکننده مقادیر به شرح جدول 4 می‌باشد.

جدول 4) مقادیر لازم برای تهیه ۱۰ میلی‌لیتر ژل جداکننده با درصدهای متفاوت از آکریل آماید

درصد آکریل آماید 6% 8% 10% 12% 15%
                H2O 5.2ml 4.6ml 3.8ml 3.2ml 2.2ml
Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 2ml 2.6ml 3.4ml 4ml 5ml
1.5M Tris(pH=8.8) 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml
10% (w/v)SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl
  • AP و TEMED قبل از شروع کار و آخرین ترکیباتی هستند که باید اضافه شوند.

[1]-Separating gel or Resolving gel

[2]-Stacking gel

 

 

/15 دیدگاه /توسط