سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح طراحی پرایمر و آموزش آن پرداخته است.

طراحی پرایمر و کاربردهای آن

برای تکثیر قطعه ای از ژنوم به منظور انجام فعالیت هایی همچون بررسی بیان ژن، انگشت نگاری ژنومی، تشخیص هویت افراد، بررسی اختلالات ژنومی و بیماری های ژنتیکی، بیماری های ویروسی و…توسط PCR، وجود توالی کوتاهی به نام پرایمر ضروری است. در واقع، نیاز است برای شروع فعالیت آنزیم های دی ان ای پلیمراز که رونوسی از دی ان ای را انجام می‌دهند، ابتدا چند نوکلئوتید اولیه رشته مورد نظر رونویسی شده باشد تا آنزیم نوکلئوتید های مکمل بعدی را به آنها اضافه کرده و این عمل را تا پایان همانند سازی ژن انجام دهد.

در شرایطی که می‌خواهیم دی ان ای را در آزمایشگاه تکثیر کنیم، به دلیل عدم حضور آنزیم های سازنده‌ی پرایمر، نیاز است پرایمر را از قبل طراحی کرده و در شرایط آزمایش در مجاورت سایر عوامل قرار دهیم. این عمل اصطلاحا طراحی پرایمر نام دارد و برای انجام آن می‌توان از سایت ها و نرم افزارهای مرتبط بهره برد.

طراحی پرایمر اصولی را داراست که با رعایت آنها، می‌توانیم کیفیت و بازدهی واکنش را بالا ببریم. در این مقاله ابتدا به برخی از مهم‌ترین اصول طراحی پرایمر اشاره می کنیم و سپس چگونگی طراحی پرایمر را بررسی می‌کنیم.

ویژگی‌های پرایمر مناسب

1.طول پرایمرها بین 18 تا 23 جفت باز باشد. کوتاه بودن پرایمر سبب اتصال‌ غیر اختصاصی‌ شده و افزایش طول پرایمر هیبریداسیون‌ را سخت می کند.

2.دمای ذوب (Tm) دو پرایمر به هم نزدیک  و در حدود 55 تا 65 درجه باشد.

3.دمای ذوب پرایمرها به دمای اتصالشان  (annealing) نزدیک باشد.

4.درصد CG پرایمر ها با هم برابر و حدودا 45 تا 60 درصد باشد.

5.پرایمر ها اختصاصی عمل کنند یعنی در کل ژنوم گونه‌ی مورد مطالعه،فقط توانایی اتصال به توالی مورد نظر ما را داشته باشند.

6.پرایمر تشکیل دایمر خودی (Self-dimer) ندهد؛ برای این منظور بهتر است قطعه ای انتخاب شود که درصد بازهای مکمل کمی داشته باشد(مثلا دارای G و T غالب باشد).

7.پرایمر تشکیل دایمر متقابل (Hetero-dimer) و ساختار سنجاق سری (Hairpin) ندهد.

با در نظر گرفتن موارد بالا می‌توانیم پرایمر مناسب را برای انجام  PCRطراحی کنیم.

برای طراحی پرایمر در ابتدا بایم مشخصات و توالی ژن مورد نظر را بررسی کنیم؛بدین منظور می‌توانیم از سایت‌هایی از جمله NCBI و  UCSCاستفاده کنیم و نام ژن مورد نظر و گونه مورد مطالعه را در بخش مربوطه جست‌و‌جو نماییم.

طراحی پرایمر در سایت :NCBI

در قسمت nucleotide این سایت،نام ژن و گونه مورد نظر را سرچ می کنیم و مشخصات ژن نمایش داده می‌شود،با کلیک بر روی گزینه FASTA می‌توانیم توالی ژن موردنظر را بطور کامل مشاهده کرده و سپس برای محدوده موردنظر خود،با توجه به موارد گفته شده بهترین پرایمرهای ممکن را انتخاب کنیم.پرایمر Forward عیننا کپی قسمتی از توالی ژنوم و پرایمر reverse مکمل و معکوس قسمتی از توالیست (زیرا توالی بصورت’5 به ‘3 می‌باشد). علاوه بر موارد مشاهده شده،بهتر است اولین نوکلئوتید در سر ‘3 (یعنی در پرایمر reverse) یک پورین (C یا G) باشد.زیرا اتصال سر ‘3 به پرایمر بسیار مهم است و چون بین بازهای پورینی سه پیوند هیدروژنی برقرار می‌شود، اتصال محکم خواهد بود. اما بطور کل باید سعی شود انتهای ‘3 غنی از پورین نباشد،زیر افزایش مقدار پورین باعث کاهش اختصاصیت واکنش خواهد شد.

پس از انتخاب پرایمرها، می‌توانیم در قسمت primer-blast همین سایت،اختصاصی بودن پرایمر ها را بررسی کنیم. برای این کار توالی پرایمر های forward و  reverseرا در کادرهای مربوطه وارد کرده و در قسمت پایین صفحه نوع ارگانیسم را انتخاب میکنیم. سپس با کلیک برروی گزینه Get primers نتیجه را خواهیم دید. در صفحه نتیجه، تمام توالی هایی را که در ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه، امکان اتصال به این پرایمرها را دارند،مشاهده خواهیم کرد. اگر بیش از یک توالی مکمل پرایمرها باشد،یعنی پرایمر طراحی شده اختصاصی عمل نکرده و مناسب نمی‌باشد.

دیگر نکته ی قابل توجه در این بخش self-3 complementarity است.در واقع این مشخصه بیان می کند که سر ‘3 چقدر تمایل دارد به خودش متصل شود. هرچه این عدد کمتر باشد مناسب تر است و برای داشتن پرایمر قابل قبول بهتر است self-3 complementarity  بین 0 تا 2 باشد.

Self-complementarity برآیند کل بوده و مجاز است عدد بزرگتری را به خود اختصاص دهد. (حدودا تا 5)

طراحی پرایمر در سایت UCSC:

اگر نخواهیم طراحی پرایمر را بصورت دستی انجام دهیم،می‌توانیم از پرایمرهای از پیش طراحی شده سایت UCSC استفاده کنیم. برای استفاده از این سایت در قسمت Genome نام ژن موردنظر را جست و جو می‌کنیم و سپس در صفحه ی نتیجه،UCSC Genes را انتخاب می‌کنیم. حالا روی قسمت Exon Primer  کلیک کرده و در صفحه نمایش داده شده submit را انتخاب می‌کنیم.

پس از کلیک بر روی Results پرایمرهای مناسب محدوده‌ی مورد نظر ما،با تمام خصوصیات از جمله طول قطعات و دمای ذوب و درصد GC ظاهر می‌شوند.همچنین جایگاه پرایمرها بر روی ژنوم قابل مشاهده است.

در قسمت پایین تر این صفحه، در بخش  ADDITIONAL OLIGOS سایت پرایمرهای بیشتری را به ما پیشنهاد می کند تا با توجه به مشخصات آنها بهترین پرایمر را انتخاب کنیم.

همچنین می‌توانیم طراحی پرایمر را با کمک سایت primer3 انجام دهیم.

طراحی پرایمر در سایت Primer3:

برای این کار باید توالی خاصی که قصد تکثیر آن را داریم را در دست داشته باشیم،این توالی را هم از سایت NCBI و هم از سایت UCSC می‌توانیم بدست بیاوریم. بهتر است از قسمت‌هایی که نواحی مختلف ژن شامل اگزون و اینترون را به تفکیک نشان می‌دهند استفاده کنیم. سپس توالی هدف خود را پیدا کرده و قسمت هایی از رشته که قبل و بعد از قطعه هدف ما قرار دارند را انتخاب کنیم. برای مثال اگر قصد تکثیر اگزون خاصی را داریم، میتوانیم ژن مورد نظر را در بخش GENE سایت NCBI  جست و جو کنیم. در صفحه ی نتیجه خطوط باریک اینترون‌ها و قطعات پهن تر اگزون ها می‌باشند. برای مثال اگر توالی هدف ما اینترون چهارم این ژن باشد،با انتخاب قسمت‌های حوالی این ژن و سپس انتخاب گزینه Zoom on range روی قسمت مورد نظر zoom می‌کنیم.

سپس می‌توانیم یک بار با نشاندار کردن ناحیه ی اگزونی و انتخاب گزینه download selected،توالی اگزون را دانلود کرده و بار دیگر به همین روش توالی اگزون به همراه مقداری از اینترون های اطراف را دانلود و save کنیم. توالی ای که شامل اینترون و اگزون است را انتخاب کرده و در سایت primer3 داخل کادر بالا کپی می کنیم.

حال اگر چند نوکلیوتید از ابتدای اگزون کپی کرده و در سایت Primer3 ، Ctrl+F را بزنیم، ابتدای اگزون بصورت رنگی مشخص خواهد شد. به همین ترتیب می توانیم انتهای اگزون را نیز پیدا کنیم.

سپس ابتدا و انتهای توالی موردنظر خود (در اینجا اگزون) را  توسط  علامت های [  و ] محدود می‌کنیم تا پرایمر ها خارج از محدوده‌ی مورد نظر ما طراحی شده و توالی هدف کاملا تکثیر شود.

می‌توانیم در بخش General setting و Advanced setting تعداد جفت پرایمرهایی که می خواهیم در نتیجه مشاهده کنیم،طول قطعه ای که می خواهیم تکثیر کنیم و ویژگی های پرایمرها از جمله دمای ذوب و درصد CG و… را مشخص کنیم.

Pick Primers را انتخاب می‌کنیم و نتیجه بصورت زیر ظاهر می‌شود.

در نتایج بدست آمده جفت پرایمری را که بهترین شرایط را داراست انتخاب می کنیم.

در این مرحله برای اطمینان از اختصاصیت پرایمرها، می‌توانیم از قسمت PCR  همین سایت و یا از قسمت blast سایت  NCBI به ترتیب ذکر شده استفاده نماییم.

جهت بررسی پرایمرها از نظر تشکیل انواع دایمر و یا Hairpin  می بایست از سایت Oligo analyzer  استفاده کنیم. پس از ورود به بخش Oligo analyzer tools توالی هر یک از پرایمر ها را در کادر مشخص شده وارد و گزینه hairpin را انتخاب می‌کنیم.

به طریق مشابه از لحاظ ایجاد self-dimer بررسی می کنیم . مشخصه ی مهم  Delta G واکنش است که هر چه منفی تر باشد به این معناست که تمایل پرایمر برای ایجاد دایمر بالاتر است. به طور کلی عدد  Delta G تا حدود منفی 9 قابل قبول است اما بسته به این که پرایمر را دقیقا برای چه کاری مورد استفاده قرار می دهیم این عدد متغیر خواهد بود.

سپس گزینه hetero-dimer را انتخاب کرده و توالی های forward و reverse را وارد می‌کنیم و پس از کلیک روی calculate،   Delta G واکنش را بررسی می کنیم.

گردآورنده: سرکار خانم لیلا تنهایی