سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح دستگاه الایزا ریدر و کاربردهای آن پرداخته است.

دستگاه الایزا چیست؟

الایزا ریدرها که به آنها پلیت ریدر و یا میکروپلیت ریدر نیز گفته می شود، ابزارهایی هستند که در تشخیص رویدادهای زیست شناسی، شیمیایی یا فیزیکی نمونه ها در صفحه های میکروتیتر مورد استفاده قرار می‌گیرند. این دستگاه کاربرد گسترده ای در کشف دار، اعتبارسنجی‌های زیست‌شناسی، کنترل کیفیت و فرآیندهای تولید در صنایع دارویی و زیست‌فناوری دارد. فرمت‌های رایج تر میکروپلیت که در تحقیقات آکادمیک و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می‌گیرد دارای ۹۶ چاهک (ماتریس ۸ در ۱۲) است. میکروپلیت های سنگین تر (که ۳۸۴ یا ۱۵۳۶ چاهک دارند)، عموما برای غربالگری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد و توان را افزایش و هزینه را کاهش می‌دهد.

حالت های تشخیصی رایج دستگاه میکروپلیت ریدر شامل جذب، مشاهده فلورسانس، لومینسانس، قطبش فلوئورسانس و Time-resolved fluorescence است.

جذب

تشخیص جذب در میکروپلیت ریدرها بیش از سه دهه است که قابل دسترس است و برای اعتبارسنجی هایی نظیر الایزا، اندازه گیری پروتئین و نوکلئیک اسید یا فعالیت آنزیم استفاده می‌شود. یک منبع نور نمونه را با استفاده از طول موج خاص (انتخاب شده توسط یک قطعه نوری یا مونوکروماتور) روشن می کند و یک ردیاب نور که در طرف دیگر چاه قرار دارد، مقدار نور عبوری از طریق نمونه را اندازه گیری می کند. مقدار نور عبور داده شده،عموما به غلطت مولکول مورد نظر مربوط است. ارزیابی آمونیوم،نیترات،نیتریت،اوره،آهن و اورتوفسفات، نمونه‌هایی از آنالیزهایی هستند که به روش میکروپلیت ریدر تبدیل شده اند. بیشتر رنگ‌ سنجی های شیمیایی اخیر،به طور مستقیم برای استفاده در میکروپلیت ریدر توسعه یافته اند.

فلورسانس

تشخیص فلوئورسانس در فرمت میکروپلیت به طور گستره در دو دهه‌ی اخیر گسترش یافته است. طیف کاربردهای آن بسیار گسترده تر از استفاده از جذب است اما این ابزار غالبا گران‌تر است. در این نوع ابزار، اولین سیستم نوری،نمونه را با استفاده از طول موج خاصی روشن می‌کند.در نتیجه‌ی این روشنایی، نمونه نور ساطع می‌کند و سیستم نوری ثانویه،این نور ساطع شده را جمع‌آوری می‌کند و آن را (با استفاده از یک فیلتر یا سیستم مونوکروماتور) از نور خارجی مجزا می‌کند و این سیگنال را با استفاده از یک ردیاب نوری همانند لوله‌ی فوتومولتیپلر اندازه گیری می‌کند. از مزایای این روش نسبت به مشاهده‌ی جذب، حساسیت است؛ و دامنه‌ی کاربرد که انتخاب گسترده ای از برچسب های فلورسنتی که امروزه موجود هستند،به دست می‌دهد. به عنوان مثال،تکنیکی که تصویربرداری کلسیمی نامیده می‌شود، شدت رنگهای حساس به کلسیم را برای ارزیابی میزان کلسیم داخل سلولی اندازه گیری می کند.

لومینسانس

لومینسانس نتیجه‌ی یک واکنش شیمیایی یا زیست‌شناسی است.ردیابی لومینسانس از لحاظ نوری ساده تر از فلورسانس است؛به این دلیل که لومینسانس نیازی به یک منبع نور برای تحریک ندارد.

یک سیستم نوری لومینسانس تشکیل شده از یک محفظه‌ی خوانش نور و یک ردیاب PMT. برخی از پلیت ریدر ها یک ردیاب PMT آنالوگ را بکار می‌برند در حالیکه بقیه دستگاه‌ها،یک ردیاب شمارنده‌ی فوتون دارند. شمارنده‌ی فوتون به طور گسترده ای به عنوان حساس ترین وسیله تشخیص لومینسانس پذیرفته شده است. برخی پلیت ریدر ها چرخ های فیلتر یا سیستم های نوری سنجش طول‌ موج مونوکروماتور قابل تنظیم را برای انتخاب طول‌ موج‌های لومینسانس خاص را پیشنهاد می‌دهند.

قطبش فلورسانس

این تکنیک نیز بسیار شبیه به ردیابی FI است. تنها تفاوت دراین است که این سیستم شامل فیلترهای پولاریزاسیون است که در مسیر نور قرارگرفته‌اند. نمونه های داخل میکروپلیت با استفاده از نور پولاریزه (قطبیده شده) تحریک می‌شوند. بسته به تحرک مولکول‌های فلورسنتی که در چاه ها هستند، نور ساطع شده می‌تواند پولاریزه یا غیرپولاریزه باشد.برای مثال،مولکول‌های بزرگ موجود در محلول(مثل پروتئین) که به خاطر اندازه‌شان نسبتا آرام می‌چرخند، وقتی با نور پولاریزه تحریک می‌شوند، نور پولاریزه را ساطع می‌کنند. از سوی دیگر، چرخش سریع مولکول‌های کوچک‌تر، سبب دپولاریزه شدن سیگنال می‌شود. سیستم تحریک در این پلیت ریدر، فیلترهای پولاریزه را برای بررسی پولاریزه بودن (قطبیدگی) نور ساطع شده بکار می‌برد.سطح پایین پولاریزاسیون، نشان می‌دهد که مولکول ‌های کوچک آزادانه در محلول حرکت می‌کنند. سطح بالای قطبیدگی نور ساطع شده نشان‌ دهنده‌ این است که فلورسنت به یک کمپلکس مولکولی بزرگتر متصل شده است. در نتیجه، یکی از اساسی ترین کاربردهای ردیابی FI، ارزیابی اتصال مولکولی است؛ زیرا می‌توان تشخیص داد که آیا یک مولکول کوچک فلورسنت به یک مولکول بزرگتر غیر فلورسنت متصل شده یا نه؛ بدین صورت که اتصال سبب کاهش سرعت چرخش مولکول فلورسنت، و در نتیجه افزایش پولاریزاسیون می‌شود.

 

Time-resolved fluorescence

Time-resolved fluorescence  یا TRF بسیار شبیه به اندازه گیری شدت فلورسانس (FI) است.  تنها تفاوت آنها در زمان بندی فرایند تحریک / اندازه گیری است.  هنگام اندازه‌گیری FI، فرایندهای برانگیختگی و انتشار همزمان هستند و نور ساطع شده توسط نمونه در حین تحریک اندازه گیری می شود.هرچند سیستم های انتشار در از بین بردن نور تحریک قبل از رسیدن به ردیاب بسیار کارآمد هستند،میزان نور تحریک در مقایسه با نور انتشار به گونه ای است که اندازه گیری FI همیشه سیگنال های پس زمینه نسبتاً بالایی را نشان می دهد. TRF راه حلی برای این مشکل ارائه می‌دهد که مبتنی بر استفاده از فلورسنت های خاص تحت عنوان لانتانیدها است که این خاصیت را دارند که پس از گذشت مدت طولانی از تحریک (در حدود میلی ثانیه)، از خود نور ساطع می‌کنند؛ در صورتی که بیشتر رنگ‌های فلورسنت استاندارد فقط تا چند نانوثانیه پس از برانگیخته شدن، نور منتشر می‌کنند. در نتیجه می‌توان لانتانیدها را با استفاده از یک منبع نور پالس تحریک کرد و بعد نتیجه را اندازه‌گیری کرد. در این صورت پالس‌های زمینه‌ای در مقایسه با سنجش استاندارد FI کمتر خواهد بود. اشکالاتی که وجود دارد این است که ابزارها و معرف‌ها معمولا گران هستند و این که کاربردها باید سازگار با استفاده از رنگ‌های لانتانید خیلی خاص باشند.کاربرد اصلی TRF در غربالگری دارو،تحت عنوان TR-FRET (time-resolved fluorescence energy transfer) یافت می شود. سنجش TR-FRET بسیار مقاوم است و می‌توان به راحتی آن را در مقادیر کوچک بکار برد.استحکام،قابلیت خودکارسازی و کوچک سازی ویژگی‌های مورد توجه در آزمایشگاه غربالگریست.

پراکندگی نور و نفلومتری

پراکندگی نور و نفلومتری، روش‌هایی برای تعیین قسمت حل‌ نشده‌ یک محلول هستند. یک باریکه‌ نور از نمونه عبور داده می‌شود و این نور توسط ذرات معلق پراکنده می‌شود. نور پراکنده‌ای که در قسمت دیگر محلول اندازه‌گیری می‌شود، نشان‌ دهنده‌ مقدار ذرات حل‌ نشده‌ موجود در محلول است. کاربردهای رایج پراکندگی نور/نفلومتری، شامل غربالگری خودکار حلالیت دارو،سینتیک رشد میکروبی طولانی مدت،لخته سازی و… است.

ابزارها و ارزیابی‌ها

بسیاری از روش های تشخیصی (جذب،فلورسنت،لومینسنس و….) بصورت مستقل در میکروپلیت های اختصاصی در دسترس هستند، اما اغلب بصورت ترکیب شده در یک دستگاه یافت می‌شوند. همچنین ابزارهایی برای اندازه‌گیری نور دینامیک و استاتیک پراکنده شده از نمونه‌ها در میکروپلیت موجودند. محدوده‌ی کاربرد میکروپلیت ریدرهای چند حالته بسیار وسیع است.

 کاربردهای این دستگاه‌ الایزا

الایزا

ارزیابی پروتئین و رشد سلولی

اینتراکشن های پروتئین-پروتئین

ارزیابی نشانگرها

کمیت نوکلئیک اسید

اینتراکشن های مولکولی

فعالیت آنزیمی

سمیت سلولی

کمیت ATP

ایمنی‌سنجی

کشف دارو

در حالیکه پلیت ریدر عموما به موارد گفته شده در بالا اشاره دارد،ابزارهای متنوع دیگری نیز در دسترسند.چند نمونه از دستگاه‌هایی که با فرمت میکروپلیت ریدر کار می‌کنند عبارتند از:

-پلیت ریدر های ELISPOT: برای شمارش لکه‌های رنگی که در دوره سنجش ELISPOT شکل می‌گیرند، استفاده می‌شوند.

– High-content screening (HSC): سیستم‌های غربالگری که هر چاه را برای ردیابی جمعیت سلولی با وضوح بالا تصویرسازی می‌کنند.

-ابزارهای بدون لیبل که از میکروپلیت‌های تخصصی برای اندازه‌گیری وقایع اتصال، بدون استفاده از نشانگر های شیمیایی استفاده می‌کنند.

 

Gel documentation system

 Gel documentation به ابزاری گفته می‌شود که به طور گسترده در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی برای تصویرسازی و مستندسازی اسید نوکلئیک و پروتئین‌های نشاندار شده در ژل های پلی آکریلامید یا آگارز یا سلولز مورد استفاده قرار می گیرد. این ژل ها به طور معمول توسط اتیدیوم برومید یا سایر رنگ‌های اسید نوکلئیک مانند GelGreen،رنگ می شوند. سیستم ها بسته به توان و نوع نمونه ، تنظیمات متنوعی دارند. به طور کلی، یک ژل داک شامل یک منبع نور ماوراء بنفش (UV)، یک هود یا اتاق تاریک برای محافظت از منابع نوری خارجی و محافظت از کاربر در برابر اشعه ماوراء بنفش، و یک دوربین CMOS برای ثبت تصویر است. ژل الکتروفورز در اتاق تاریک قرار می‌گیرد و نور (عموما فلورسانس) به ژل تابانده می‌شود؛ در نتیجه نشانگر هایی که به پروتئین یا DNA متصل شده و نسبت به نور حساسیت نشان می‌دهند،با تابش نور مرئی،پروتئین و یا DNA را بصورت رنگی نشان می‌دهند.و دوربین مخصوص عکس آن را ثبت میکند؛ سپس اطلاعات مربوطه به وسیله‌ی نرم افزار های خاص قابل بررسی است.

مدلهای تصویری که اخیراً تولید شده اند همچنین شامل ویژگی هایی برای کنترل انواع فلورسانس و لومینسانس با دوربین هایی هستند که تا 60- درجه سانتیگراد خنک شده اند. سایر ویژگی های پیشرفته عبارتند از: چاپ سریع روی دوربین و اتصال به Wi-Fi جهت کنترل توسط تلفن های هوشمند و تبلت.

کاربردها دستگاه الایزا ریدر 

تصویربرداری از ژل و بلات

 شمارش کلنی

 ایمنی‌سنجی

 تشخیص پروتئین

 تعیین تغییرات پس از ترجمه

 الکتروفورز دو بعدی

 کمیت پروتئین

انواع سیستم های ژل Doc

 نوع سیستم های مستندسازی ژل مورد نیاز آزمایشگاه، بستگی به روش کاربرد و تشخیص دارد.

 کِمی‌لومینسانس: به طور کلی برای وسترن بلات مورد استفاده می گیرد.

ردیاب های اتیدیوم برمید دیجیتال/CCD ، مادون قرمز، کِمی‌لومینسانس، فلورسانس 3 رنگ، چگالی سنجی و نور مرئی در دسترسند تا خوانش کمی از نوارهای اسید نوکلئیک و پروتئین، بلات های نقطه ای و میکروپلیت ها انجام گیرد.

 رادیوگرافی خودکار فیلم: برای رادیوایزوتوپ ها استفاده می شود.

 لیزر: حساسیت بالا و اندازه گیری دقیق برای رادیوایزوتوپ ها و انعطاف پذیری در انتخاب فیلترهای انتشار ؛ از جمله فیلترهای سفارشی برای رنگهایی مانند Cy.

Multiplex: چندین سیگنال فلورسنت را همزمان و در همان آزمایشات تشخیص داده و تصویر می‌کند و یا سیگنال های رادیوایزوتوپی، لومینسانس و رنگ سنجی را تشخیص می‌دهد.

Phosphoimager: حساسیت پیشرفته برای کاربردهای فلورسانس چندگانه و رادیو ایزوتوپ ها، انعطاف در انتخاب فیلترهای انتشار، از جمله فیلترهای سفارشی.

اگر به رشته زیست شناسی علاقه مند هستید، خوشحال میشیم دیگر مقالات سایت رو مطالعه بفرمایید.

گردآورنده : خانم لیلا تنهایی