نوشته‌ها
سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح طراحی پرایمر و آموزش آن پرداخته است.
طراحی پرایمر و کاربردهای آن
برای تکثیر قطعه ای از ژنوم به منظور انجام فعالیت هایی همچون بررسی بیان ژن، انگشت نگاری ژنومی، تشخیص هویت افراد، بررسی اختلالات ژنومی و بیماری های ژنتیکی، بیماری های ویروسی و…توسط PCR، وجود توالی کوتاهی به نام پرایمر ضروری است. در واقع، نیاز است برای شروع فعالیت آنزیم های دی ان ای پلیمراز که رونوسی از دی ان ای را انجام می‌دهند، ابتدا چند نوکلئوتید اولیه رشته مورد نظر رونویسی شده باشد تا آنزیم نوکلئوتید های مکمل بعدی را به آنها اضافه کرده و این عمل را تا پایان همانند سازی ژن انجام دهد.
در شرایطی که می‌خواهیم دی ان ای را در آزمایشگاه تکثیر کنیم، به دلیل عدم حضور آنزیم های سازنده‌ی پرایمر، نیاز است پرایمر را از قبل طراحی کرده و در شرایط آزمایش در مجاورت سایر عوامل قرار دهیم. این عمل اصطلاحا طراحی پرایمر نام دارد و برای انجام آن میتوان از سایت ها و نرم افزارهای مرتبط بهره برد.
طراحی پرایمر اصولی را داراست که با رعایت آنها، میتوانیم کیفیت و بازدهی واکنش را بالا ببریم. در این مقاله ابتدا به برخی از مهم‌ترین اصول طراحی پرایمر اشاره می کنیم و سپس چگونگی طراحی پرایمر را بررسی میکنیم.
ویژگی‌های پرایمر مناسب
1.طول پرایمرها بین 18 تا 23 جفت باز باشد. کوتاه بودن پرایمر سبب اتصال غیر اختصاصی شده و افزایش طول پرایمر هیبریداسیون را سخت می کند.
2.دمای ذوب (Tm) دو پرایمر به هم نزدیک و در حدود 55 تا 65 درجه باشد.
3.دمای ذوب پرایمرها به دمای اتصالشان (annealing) نزدیک باشد.
4.درصد CG پرایمر ها با هم برابر و حدودا 45 تا 60 درصد باشد.
5.پرایمر ها اختصاصی عمل کنند یعنی در کل ژنوم گونه‌ی مورد مطالعه،فقط توانایی اتصال به توالی مورد نظر ما را داشته باشند.
6.پرایمر تشکیل دایمر خودی (Self-dimer) ندهد؛ برای این منظور بهتر است قطعه ای انتخاب شود که درصد بازهای مکمل کمی داشته باشد(مثلا دارای G و T غالب باشد).
7.پرایمر تشکیل دایمر متقابل (Hetero-dimer) و ساختار سنجاق سری (Hairpin) ندهد.
با در نظر گرفتن موارد بالا میتوانیم پرایمر مناسب را برای انجام PCRطراحی کنیم.
برای طراحی پرایمر در ابتدا بایم مشخصات و توالی ژن مورد نظر را بررسی کنیم؛بدین منظور میتوانیم از سایت‌هایی از جمله NCBI و UCSCاستفاده کنیم و نام ژن مورد نظر و گونه مورد مطالعه را در بخش مربوطه جست‌و‌جو نماییم.
طراحی پرایمر در سایت :NCBI
در قسمت nucleotide این سایت،نام ژن و گونه مورد نظر را سرچ می کنیم و مشخصات ژن نمایش داده میشود،با کلیک بر روی گزینه FASTA میتوانیم توالی ژن موردنظر را بطور کامل مشاهده کرده و سپس برای محدوده موردنظر خود،با توجه به موارد گفته شده بهترین پرایمرهای ممکن را انتخاب کنیم.پرایمر Forward عیننا کپی قسمتی از توالی ژنوم و پرایمر reverse مکمل و معکوس قسمتی از توالیست (زیرا توالی بصورت’5 به ‘3 می‌باشد). علاوه بر موارد مشاهده شده،بهتر است اولین نوکلئوتید در سر ‘3 (یعنی در پرایمر reverse) یک پورین (C یا G) باشد.زیرا اتصال سر ‘3 به پرایمر بسیار مهم است و چون بین بازهای پورینی سه پیوند هیدروژنی برقرار میشود، اتصال محکم خواهد بود. اما بطور کل باید سعی شود انتهای ‘3 غنی از پورین نباشد،زیر افزایش مقدار پورین باعث کاهش اختصاصیت واکنش خواهد شد.
پس از انتخاب پرایمرها، میتوانیم در قسمت primer-blast همین سایت،اختصاصی بودن پرایمر ها را بررسی کنیم. برای این کار توالی پرایمر های forward و reverseرا در کادرهای مربوطه وارد کرده و در قسمت پایین صفحه نوع ارگانیسم را انتخاب میکنیم. سپس با کلیک برروی گزینه Get primers نتیجه را خواهیم دید. در صفحه نتیجه، تمام توالی هایی را که در ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه، امکان اتصال به این پرایمرها را دارند،مشاهده خواهیم کرد. اگر بیش از یک توالی مکمل پرایمرها باشد،یعنی پرایمر طراحی شده اختصاصی عمل نکرده و مناسب نمی‌باشد.
دیگر نکته ی قابل توجه در این بخش self-3 complementarity است.در واقع این مشخصه بیان می کند که سر ‘3 چقدر تمایل دارد به خودش متصل شود. هرچه این عدد کمتر باشد مناسب تر است و برای داشتن پرایمر قابل قبول بهتر است self-3 complementarity بین 0 تا 2 باشد.
Self-complementarity برآیند کل بوده و مجاز است عدد بزرگتری را به خود اختصاص دهد. (حدودا تا 5)
طراحی پرایمر در سایت UCSC:
اگر نخواهیم طراحی پرایمر را بصورت دستی انجام دهیم،میتوانیم از پرایمرهای از پیش طراحی شده سایت UCSC استفاده کنیم. برای استفاده از این سایت در قسمت Genome نام ژن موردنظر را جست و جو میکنیم و سپس در صفحه ی نتیجه،UCSC Genes را انتخاب میکنیم. حالا روی قسمت Exon Primer کلیک کرده و در صفحه نمایش داده شده submit را انتخاب میکنیم.
پس از کلیک بر روی Results پرایمرهای مناسب محدوده‌ی مورد نظر ما،با تمام خصوصیات از جمله طول قطعات و دمای ذوب و درصد GC ظاهر می‌شوند.همچنین جایگاه پرایمرها بر روی ژنوم قابل مشاهده است.
در قسمت پایین تر این صفحه، در بخش ADDITIONAL OLIGOS سایت پرایمرهای بیشتری را به ما پیشنهاد می کند تا با توجه به مشخصات آنها بهترین پرایمر را انتخاب کنیم.
همچنین میتوانیم طراحی پرایمر را با کمک سایت primer3 انجام دهیم.
طراحی پرایمر در سایت Primer3:
برای این کار باید توالی خاصی که قصد تکثیر آن را داریم را در دست داشته باشیم،این توالی را هم از سایت NCBI و هم از سایت UCSC میتوانیم بدست بیاوریم. بهتر است از قسمت‌هایی که نواحی مختلف ژن شامل اگزون و اینترون را به تفکیک نشان می‌دهند استفاده کنیم. سپس توالی هدف خود را پیدا کرده و قسمت هایی از رشته که قبل و بعد از قطعه هدف ما قرار دارند را انتخاب کنیم. برای مثال اگر قصد تکثیر اگزون خاصی را داریم، میتوانیم ژن مورد نظر را در بخش GENE سایت NCBI جست و جو کنیم. در صفحه ی نتیجه خطوط باریک اینترون‌ها و قطعات پهن تر اگزون ها می‌باشند. برای مثال اگر توالی هدف ما اینترون چهارم این ژن باشد،با انتخاب قسمت‌های حوالی این ژن و سپس انتخاب گزینه Zoom on range روی قسمت مورد نظر zoom میکنیم.
سپس میتوانیم یک بار با نشاندار کردن ناحیه ی اگزونی و انتخاب گزینه download selected،توالی اگزون را دانلود کرده و بار دیگر به همین روش توالی اگزون به همراه مقداری از اینترون های اطراف را دانلود و save کنیم. توالی ای که شامل اینترون و اگزون است را انتخاب کرده و در سایت primer3 داخل کادر بالا کپی می کنیم.
حال اگر چند نوکلیوتید از ابتدای اگزون کپی کرده و در سایت Primer3 ، Ctrl+F را بزنیم، ابتدای اگزون بصورت رنگی مشخص خواهد شد. به همین ترتیب می توانیم انتهای اگزون را نیز پیدا کنیم.
سپس ابتدا و انتهای توالی موردنظر خود (در اینجا اگزون) را توسط علامت های [ و ] محدود میکنیم تا پرایمر ها خارج از محدوده‌ی مورد نظر ما طراحی شده و توالی هدف کاملا تکثیر شود.
میتوانیم در بخش General setting و Advanced setting تعداد جفت پرایمرهایی که می خواهیم در نتیجه مشاهده کنیم،طول قطعه ای که می خواهیم تکثیر کنیم و ویژگی های پرایمرها از جمله دمای ذوب و درصد CG و… را مشخص کنیم.
Pick Primers را انتخاب میکنیم و نتیجه بصورت زیر ظاهر میشود.
در نتایج بدست آمده جفت پرایمری را که بهترین شرایط را داراست انتخاب می کنیم.
در این مرحله برای اطمینان از اختصاصیت پرایمرها، میتوانیم از قسمت PCR همین سایت و یا از قسمت blast سایت NCBI به ترتیب ذکر شده استفاده نماییم.
جهت بررسی پرایمرها از نظر تشکیل انواع دایمر و یا Hairpin می بایست از سایت Oligo analyzer استفاده کنیم. پس از ورود به بخش Oligo analyzer tools توالی هر یک از پرایمر ها را در کادر مشخص شده وارد و گزینه hairpin را انتخاب میکنیم.
به طریق مشابه از لحاظ ایجاد self-dimer بررسی می کنیم . مشخصه ی مهم Delta G واکنش است که هر چه منفی تر باشد به این معناست که تمایل پرایمر برای ایجاد دایمر بالاتر است. به طور کلی عدد Delta G تا حدود منفی 9 قابل قبول است اما بسته به این که پرایمر را دقیقا برای چه کاری مورد استفاده قرار می دهیم این عدد متغیر خواهد بود.
سپس گزینه hetero-dimer را انتخاب کرده و توالی های forward و reverse را وارد میکنیم و پس از کلیک روی calculate، Delta G واکنش را بررسی می کنیم.
گردآورنده: سرکار خانم لیلا تنهایی
بیوانفورماتیک چیست؟
سایت ویستاژن در این مقاله به تعریف علم بیوانفورماتیک پرداخته است. در صورت داشتن هرگونه سوال آن را در قسمت نظرات مطرح کرده تا در اسرع وقت توسط کارشناسان سایت پاسخ داده شود.
در دنیای کنونی و در این عرصه‌ی پرشکوه پیشرفت علم و فناوری ، رفته‌رفته توجه افراد بر ریز مولکول ها و مطالعه‌ی علوم سلولی جلب شده و بیشتر بر روی DNA و کاربردهای آن تمرکز میشود. این سلسله نوکلئوتید کوچک و پیچیده ، اساس و بنیان زندگی هر جانداری را مشخص میکند و همانطور که میدانیم ، شناخت این مولکول، اولین و مهم ترین گام برای ایجاد روش های بیشتر در راستای استفاده گوناگون از آن در زمینه های مختلف است . تلاش دنیای مدرن مولکولی امروز نیز درک دنیای خاموش اما شگفت انگیزِ دنیای سلولی و سلولهای زنده است. در همین راستا، بیوانفورماتیک علمی نوین است که در آن با استفاده از کامپیوتر ، نرم افزارهای کامپیوتری و بانکهای اطلاعاتی میتوان به مسائل بیولوژیکی بخصوص در زمینه‌های سلولی و مولکولی دسترسی پیدا کرد .
با پیشرفت و گسترش اطلاعات در زمینه علم ژنتیک و شناخت دقیق تر ژن ها و توالی آنها ، ژن ها عامل کنترل اعمال و اتفاقات درون سلول شناخته شدند. همین امر باعث شد که توجهات زیادی به آن جلب شود و از جنبه های مختلف مورد بررسی قرار گیرد. در واقع با علم بیوانفورماتیک سعی می شود تا یافته ها و اطلاعات گستره تری درباره ژن ها و محصول عملکردی آنها؛ یعنی پروتئین ها بدست آید.
بیوانفورماتیک شامل ادغام رایانه ها، ابزارهای نرم افزاری و بانکهای اطلاعاتی در تلاش برای پرداختن به سؤالات زیست شناختی است. دو فعالیت مهم در مقیاس بزرگ که از بیوانفورماتیک استفاده می کنند ژنومیک و پروتئومیکس هستند. ژنومیک به آنالیز ژنوم اشاره دارد. می توان ژنوم را به عنوان مجموعه ای کامل از توالی های DNA تصور کرد که برای صفاتی که از نسلی به نسل دیگر منتقل می شود، کد گذاری شده است. این توالی های DNA شامل همه ژن ها (واحد عملکردی و فیزیکی وراثت منتقل شده از والدین به فرزندان) و رونوشت ها (نسخه های RNA که گام اولیه در رمزگشایی اطلاعات ژنتیکی است) موجود در ژنوم است. بنابراین ، ژنومیک به توالی و تجزیه و تحلیل همه این موجودات ژنومی از جمله ژن ها و رونوشت ها در یک ارگانیسم اشاره دارد. پروتئومیکس ، از طرف دیگر ، به تجزیه و تحلیل مجموعه کامل پروتئین ها یا پروتئوم اشاره دارد. علاوه بر ژنتیک و پروتئومیک ، بسیاری از زمینه های زیست شناسی وجود دارد که در آن بیوانفورماتیک کاربرد دارد . هر یک از این موضوعات مهم در بیوانفورماتیک با هدف درک سیستمهای پیچیده بیولوژیکی است.
امروزه بسیاری از دانشمندان از بیوانفورماتیک به عنوان زیست شناسی سیستم ، رویکردی برای مقابله با سؤالات بیولوژیکی جدید و پیچیده یاد می کنند. زیست شناسی سیستم شامل یکپارچه سازی اطلاعات ژنومیک ، پروتئومیکس و بیوانفورماتیک برای ایجاد منظره کل سیستم از یک موجودیت بیولوژیکی است. به عنوان مثال ، چگونگی عملکرد یک مسیر سیگنالینگ در یک سلول می تواند از طریق زیست شناسی سیستم مورد بررسی قرار گیرد. ژنهای درگیر در مسیر ، نحوه تعامل آنها و چگونگی تغییر نتایج در پایین دست ، همه را می توان با استفاده از زیست شناسی سیستم مدل کرد. هر سیستمی که می تواند اطلاعات را به صورت دیجیتالی نشان دهد ، یک برنامه بالقوه برای بیوانفورماتیک را ارائه می دهد. بنابراین بیوانفورماتیک را می توان از سلولهای منفرد تا اکوسیستم های کل استفاده کرد. دانشمندان با درک و شناخت کامل لیست اجزا در یک ژنوم ، درک بهتری از سیستمهای پیچیده بیولوژیکی کسب می کنند. دانستن تعاملاتی که بین همه این قسمت ها در یک ژنوم یا پروتئوم وجود دارد ، نشان دهنده سطح بعدی پیچیدگی در سیستم است. از طریق این رویکردها ، بیوانفورماتیک این امکان را دارد که بینش های کلیدی در مورد درک و مدل سازی ما از بیماری های خاص انسانی یا انسان های سالم ارائه دهد.
پیشینه بیوانفرماتیک
شروع علم بیوانفورماتیک را می توان در سال 1968 به مارگارت دایوف و مجموعه‌ی توالی های پروتئینی معروف به اطلس توالی و ساختار پروتئین نسبت داد. یکی از آزمایش های مهم و قابل توجه در بیوانفورماتیک ، استفاده از برنامه جستجوی شباهت توالی برای شناسایی منشاء یک ژن ویروسی بود. در این مطالعه، دانشمندان از نخستین برنامه های جستجوی شباهت دنباله ای کامپیوتر (به نام FASTP) استفاده کردند ، تا بدانند که محتوای v-sis ( یک دنباله ویروسی ایجاد کننده سرطان ) بیشترین شباهت با ژن PDGF سلولی را دارد. این نتیجه غافلگیرکننده بینش مکانیکی مهمی را برای زیست شناسان فراهم آورده است در مورد اینکه ایجاد این توالی ویروسی چگونه باعث سرطان می شوند. رشد بیوانفورماتیک موازی با توسعه فناوری توالی DNA است. با همان روشی که توسعه میکروسکوپ در اواخر سال 1600 باعث تغییر علوم بیولوژیکی برای اولین بار در سلولها شد ، فناوری تعیین توالی DNA باعث تغییر در حوزه بیوانفورماتیک شد. رشد سریع بیوانفورماتیک می تواند با رشد توالی های DNA موجود در مخزن عمومی توالی های نوکلئوتیدی به نام GenBank یا همان بانک ژن ، نشان داده شود.
پروژه های تعیین توالی ژنوم به پرچمداران بسیاری از طرح های بیوانفورماتیک تبدیل شده اند. پروژه توالی ژنوم انسانی نمونه ای از یک پروژه توالی موفقیت آمیز ژنوم است ، اما بسیاری از ژنوم های دیگر نیز توالی شده و در حال توالی هستند. در حقیقت ، اولین ژنوم هایی که توالی شده اند از ویروس ها (یعنی فاژ MS2) و باکتری ها بودند و ژنوم Haemophilus آنفلوانزا Rd اولین ژنوم یک ارگانیسم زنده است که در بانک های اطلاعاتی دسته‌ی عمومی قرار می گیرد . این موفقیت با کمتری از فنآوری ژنوم انسان دریافت شد اما مشخص می شود که توالی ژنوم های دیگر گام مهمی در بیوانفورماتیک امروز است. با این حال ، توالی ژنوم به خودی خود دارای اطلاعات محدودی است. برای تفسیر اطلاعات ژنومی ، تجزیه و تحلیل مقایسه ای توالی ها باید انجام شود و یک معرف مهم برای این تجزیه و تحلیل ها پایگاه داده های توالی در دسترس عموم لازم است. بدون پایگاه داده توالی (مانند GenBank) ، که زیست شناسان اطلاعات مربوط به توالی مورد علاقه خود را ضبط کرده اند ، بسیاری از اطلاعات غنی به دست آمده از پروژه های توالی ژنوم در دسترس نخواهد بود.
روشی که در میکروسکوپ اکتشافات پیش بینی شده در زیست شناسی سلولی ، همان اکتشافات جدید در فناوری اطلاعات و زیست شناسی مولکولی و کشف های پیش بینی شده در بیوانفورماتیک است. در حقیقت ، بخش مهمی از زمینه بیوانفورماتیک توسعه فناوری جدید است که می تواند علوم بیوانفورماتیک را با سرعتی بسیار سریع پیش ببرد. از طرفی رایانه ، اینترنت ، تحولات نرم افزاری جدید ، الگوریتم های جدید و توسعه فن آوری خوشه رایانه ای به بیوانفورماتیک کمک کرده است تا از نظر مقدار داده ای که می تواند به طور کارآمد تجزیه و تحلیل شود ، جهش های بزرگی را انجام دهد. از طرف دیگر ، آزمایشگاه ، فن آوری ها و روش های جدید مانند توالی DNA ، تجزیه و تحلیل سریال بیان ژن (SAGE) ، ریزآرایه ها و شیمی های جدید طیف سنجی جرمی با سرعتی به همان اندازه آغاز شده اند که دانشمندان را قادر می سازد تا داده هایی را برای تجزیه و تحلیل با سرعت باورنکردنی تولید کنند. بیوانفورماتیک هر دو فناوری پلتفرمی را فراهم می کند که دانشمندان را قادر می سازد با مقادیر زیادی از داده های تولید شده از طریق ژنومیک و ابتکارات پروتئومیکس و همچنین رویکرد تفسیر این داده ها مقابله کنند. از بسیاری جهات ، بیوانفورماتیک ابزاری برای استفاده از روش علمی در داده های در مقیاس بزرگ فراهم می کند و باید به عنوان یک رویکرد علمی برای پرسیدن بسیاری از سؤالات بیولوژیکی جدید و متفاوت مورد بررسی قرار گیرد.
بسیاری از دانشمندان بیوانفورماتیک را هیجان انگیز می دانند زیرا این پتانسیل را دارد که بتواند به دنیای کاملاً جدیدی از سرزمین های غیرقانونی گام بگذارد . بیوانفورماتیک یک علم جدید و یک روش جدید تفکر است که به طور بالقوه می تواند منجر به بسیاری از اکتشافات بیولوژیکی مرتبط شود. اگرچه فناوری نیز بیوانفورماتیک را قدرتمند می سازد ، اما اطلاعات و دسترسی بیوانفورماتیک نیز درباره زیست شناسی بسیار زیاد است. سؤالات زیست شناختی میتوانند همه آزمایشات بیوانفورماتیک را هدایت کنند. سوالات مهم بیولوژیکی می توانند توسط بیوانفورماتیک مورد بررسی قرار گیرند و شامل درک ارتباط ژنوتیپ–فنوتیپ برای بیماری های انسانی، درک ساختار برای عملکرد روابط برای پروتئین ها و درک شبکه های بیولوژیکی باشند. برای بسیاری ، بیوانفورماتیک بسیار پرطرفدار است زیرا دانشمندان می توانند زیست شناسی و مهارتهای رایانه ای خود را در تولید معرفها برای تحقیقات بیوانفورماتیک بکار گیرند. بسیاری از دانشمندان دریافته اند که بیوانفورماتیک قلمرو جدیدی از سؤال علمی است که دارای پتانسیل بسیار خوبی برای سلامت انسان و جامعه است.
آینده بیوانفورماتیک ، از طریق ادغام است. به عنوان مثال ، ادغام طیف گسترده ای از منابع داده ها ، مانند داده های بالینی و ژنومی به ما این امکان را می دهد تا از علائم بیماری برای پیش بینی جهش های ژنتیکی استفاده کنیم و برعکس. ادغام داده های GIS مانند نقشه ها ، سیستم های هواشناسی با سلامت محصول و داده های ژنوتیپ به ما امکان پیش بینی نتایج موفقیت آمیز آزمایش های کشاورزی را می دهد. یکی دیگر از زمینه های آینده تحقیق در زمینه بیوانفورماتیک ، ژنومیک مقایسه ای در مقیاس بزرگ است. به عنوان مثال ، توسعه ابزارهایی که می توانند 10 طرفه مقایسه ژنوم ها را انجام دهند ، سرعت کشف در این زمینه از بیوانفورماتیک را به جلو سوق می دهد. در طول این خطوط، مدل سازی و تجسم شبکه های کامل سیستم های پیچیده می تواند در آینده مورد استفاده قرار گیرد تا به عنوان مثال سیستم یا سلول واکنش نشان دهد ، مثلاً به یک دارو. تاکنون یکی از بزرگترین موانع پیش روی بیوانفورماتیک ، کم بودن آمار محققان این حوزه است. این امر با تغییر رویه بیوانفورماتیک به خط مقدم پژوهش تغییر می کند اما این تاخیر در تخصص باعث ایجاد شکاف واقعی در دانش بیوانفورماتیک در جامعه تحقیقاتی شده است. سرانجام ، یک سؤال مهم تحقیقاتی برای آینده بیوانفورماتیک این خواهد بود که چگونه به صورت محاسباتی مشاهدات پیچیده بیولوژیکی ، مانند الگوهای بیان ژن و شبکه های پروتئینی را مقایسه کنیم. بیوانفورماتیک در مورد تبدیل مشاهدات بیولوژیکی به مدلی است که یک کامپیوتر آن را درک خواهد کرد. این یک کار بسیار چالش برانگیز است زیرا زیست شناسی می تواند بسیار پیچیده باشد. این مشکل نحوه دیجیتالی کردن داده های فنوتیپی مانند رفتار، الکتروکاردیوگرام و سلامت محصول به صورت قابل خواندن با رایانه، چالش های هیجان انگیزی را برای بیوانفورماتیک های آینده ایجاد می کند.
گردآورنده : سرکار خانم فاطمه علیزاده ثانی
رفرنس : www.scq.ubc.ca