سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح تکنیک الکتروفورز پردخته است.
الکتروفورز چیست؟
الکتروفورز تکنیکی است که در آزمایشگاه جهت جداسازی مولکول‌های باردار از قبیل DNA و RNA و پروتئین، بر اساس وزن مولکولی (اندازه) و یا بار الکتریکی آن ها انجام می‌گیرد.
پدیده الکتروفورز برای اولین بار در سال 1807 توسط اساتید روسی پیتر ایوانوویچ استراخوف و فردیناند فردریک ریس در دانشگاه ایالتی موسکو مشاهده شد، که متوجه شدند استفاده از یک میدان الکتریکی ثابت باعث شده است که ذرات رس در آب پخش شده و در نهایت جابجا شوند.
اساس کار الکتروفورز به این صورت است که جریان الکتریسیته در سرتاسر ژل برقرار می‌شود و بنابراین یک سوی ژل دارای بار مثبت و انتهای دیگر آن داری بار منفی می‌شود. مولکول‌های باردار شروع به حرکت می‌کنند و به سمت بار مخالف می‌روند. مولکولی که داری بار منفی است، به سمت پایانه‌ی مثبت حرکت می‌کند. به این جابجایی مولکول ها مهاجرت می‌گویند. مولکول‌های کوچکتر کمی سریعتر در طول ژل حرکت می‌کنند و در نتیجه مسافت بیشتری را نسبت به مولکول‌های بزرگتر طی می‌کنند. در نتیجه، مولکول‌ها بر اساس اندازه، از هم مجزا می‌شوند.
ژل الکتروفورز چیست؟
۱.ژل آگارز: به دلیل دارا بودن منافذ بزرگ که به مولکول‌های بزرگتر اجازه‌ی حرکت آزادنه می‌دهد، برای الکتروفورز DNA و بررسی‌های کمّی مناسب است؛ همچنین از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه تر است.
۲.ژل پلی آکریل آمید: نسبت به ژل آگارز شفاف تر بوده و برای توالی یابی DNA و بررسی جهش‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. پلی آکریل آمید این امکان را به ما می‌دهد که چگونگی اتصال پروتئین به DNA را مطالعه کنیم و یا از طریق بررسی پلاسمید، نحوه‌ی مقاوم شدن باکتر‌ی‌ها نسبت به آنتی بیوتیک را دریابیم.
برای تفکیک DNA در حالت تک رشته ای، در ژل از موادی همچون فرمالدهید و اوره استفاده می‌شود. چنین ژل های موسوم به ژل‌های واسرشت کننده، ساختار های دوم و سوم DNA را تخریب می‌کند و در نتیجه تفکیک قطعات صرفا بر اساس طول آنها خواهد بود.
اما برای واسرشت سازی پروتئین، از سدیم دو دسیل سولفات (SDS) استفاده می‌شود.
الکتروفورز ژل آگارز
آماده سازی ژل: معمولا ژل‌های آگارز برای تفکیک قطعات DNA مورد استفاده قرار می‌گیرند. غلظت آگارز مورد استفاده در ژل، بستگی به طول DNA های مورد استفاده دارد. رشته‌های کوتا‌ه‌تر DNA، در غلظت‌های بالاتر آگارز مجزا می‌شوند و مولکول‌های بزرگترنیاز به غلظت های پایین‌تر دارند. برای مثال جهت الکتروفورز اسیدهای نوکلئیک با طول صد تا هزار جفت باز، از آگارز با غلظت یک درصد و برای مولکول‌های بزرگتر از آگارز رقیق تر استفاده می‌گردد.
برای ساخت ژل، پودر آگارز با یک بافر الکتروفورزی مخلوط می‌شود و تحت اثر دمای بالا، گرم می‌شوند تا جایی که پودر آگارز بطور کامل حل شود. سپش ژل مذاب در سینی ریخته می‌شود و در یک انتها شانه قرار می‌گیرد تا چاه هایی ایجاد شود که نمونه ها داخلشان پیپت شود. وقتی ژل خنک و جامد شد (از شفافیت به حالت کدر درمی‌آید) شانه برداشته می‌شود.
سپس ژل در تانک الکتوفورز قرار می‌گیرد بافر الکتروفورز روی آن ریخته می‌شود تا سطح ژل پوشیده شود. این بافر،جریان الکتریکی را هدایت می‌کند و همچنین PH محیط الکتروفورز را ثابت نگه می دارد.نوع بافری که استفاده می‌شود بستگی به سایز تقریبی قطعات DNA در نمونه دارد.
با استفاده از رنگ‌هایی نظیر فلورسنت و یا نشانگرهای رادیواکتیو، DNA پس از جداسازی قابل مشاهده خواهد بود که بصورت باندهایی در ژل دیده می‌شود. برای مثال اگر از رنگ اتیدیوم برومید استفاده شود، زمانی که این رنگ مابین رشته‌های DNA واقع شود،تحت اثر نور فرابنفش، سیگنال فلورسانس آزاد می‌کند.
معمولا یک DNA مارکر وارد اولین چاهک می‌شود که حاوی مخلوطی از قطعات دارای وزن مشخص و شناخته شده می‌باشد و به آن ladder نیز می‌گویند. سپس DNA نمونه داخل چاهک های دیگر ژل پیپت می‌شوند. پس از اطمینان از صحت جهت‌گیری ژل و الکترودهای مثبت و منفی، درب مخزن گذاشته می‌شود. جریان الکتریکی برقرار می‌شود و DNA های با بار منفی از طرق ژل به سمت انتهای مثبت به حرکت درمی‌آیند. قطعات کوچک تر سریعتر حرکت می‌کنند و طی مدت زمانی که جریان الکتریکی برقرار است، فاصله‌ی بیشتری را طی می‌کند. مسافتی که DNA در طول ژل طی می‌کند می‌تواند توسط نمایش جابجایی رنگهای بافری مشخص شود.جریان الکتریکی تا جایی برقرار می‌ماند که اطمینان حاصل شود قطعات DNA به مقداری که برای مجزا شدنشان لازم است،جابجا شده اند؛ و نباید انقدر ادامه پیدا کند که نمونه ها از انتهای دیگر ژل خارج شوند.
سپس جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل از مخزن الکتروفورز خارج می‌شود.برای مشاهده DNA، ژل به رنگ فلورسنتی که به DNA متصل می‌شود آغشته می‌شود و سپس روی یک ترنس‌الامینتور فرابنفش قرار می‌گیرد که DNA ها را بصورت باندهای درخشان نشان می‌دهد. با توجه به این که باند تشکیل شده به کدامیک از باندهای DNA مارکر نزدیکتر است، می‌توان تشخیص داد قطعات DNA نمونه حدودا دارای چه انداز‌ه‌ای هستند.
کاربردهای الکتروفورز DNA
از جمله اهداف الکتروفورز DNA می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- انگشت نگاری DNA برای اهداف پزشکی قانونی
- انگشت نگاری DNA برای آزمایش تشخیص هویت
- انگشت نگاری DNA به منظور دستیابی به روابط تکاملی بین ارگانیسم ها
- ارزیابی واکنش PCR
- آزمایش ژن‌های مرتبط با یک بیماری خاص
الکتروفورز پروتئین
پروتئین‌های مختلف، بسته به انواع آمینواسیدهای بکار رفته در ساختارشان دارای اندازه‌های متفاوت هستند. همچنین مواد شیمیایی که به پروتئین متصل می‌شوند نیز اندازه‌ی پروتئین را تحت تاثیر قرار می‌دهند. پروتئین‌ها، همچنین در نتیجه‌ی تنوع آمینواسیدها و موادی که به آنها متصل است، از لحاظ بار الکتریکی نیز متفاوت خواهند شد.
انواع مختلف تکنیک‌های الکتروفورز برای دستیابی به اطلاعات مختلف در مورد پروتئین مورد استفاده قرار می گیرند. نوع ژلی که در الکتروفورز بکار می‌رود، وابسته به هدف انجام الکتروفورز است.
انواع الکتروفورز
الکتروفورز بر اساس اندازه
ژل‌ها عموما از پلی‌آکریل‌آمید ساخته شده اند که جهت جداسازی پروتئین‌ها بر اساس سایز استفاده می‌شوند. پروتئین‌ها ابتدا تحت اثر گرما و ماده شیمیایی به نام SDS، واسرشته می‌شوند. SDS مادی‌ای دترجنت است که پروتئین ها را داری بار منفی یکسان می‌کند و در نتیجه تفکیک پروتئین‌ها تنها بر اساس اندازه مولکولی‌شان صورت می‌گیرد.
این تکنیک SDS-PAGE (SDS-Polyacrilamide gel electrophoresis) نامیده می‌شود. پروتئین‌های کوچکتر سریعتر از پروتئین‌های کوچکتر حرکت می‌کند و این اتفاق سبب ایجاد یک سری باندهای پروتئینی در ژل می‌شود.
این روش ممکن است برای بسیاری از اهداف، از جمله تصفیه پروتئین خاص (به عنوان مثال برای جداسازی آنزیم برای صنایع غذایی) مورد استفاده قرار گیرد.
الکتروفورز بر اساس بار
الکتروفورز با ژل اگارز روشی برای تفکیک پروتئین‌ها بر اساس بار الکتریکی است. در این روش برخلاف SDS-PAGE، پروتئین ها در شکل طبیعی خود باقی می‌مانند.ژل مورد استفاده و محلول اطراف ژل نیز متفاوت است.
ویستاژن vistagene ویستا ژن
گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی