سایت ویستاژن در این مطلب به بررسی Real time PCR پرداخته است.
Real time PCR
برای مشاهده‌ی روند دقیق تکثیر طی PCR، از سیستمی تحت عنوان real time PCR استفاده می‌شود.در این روش نیازی به استفاده از الکتروفورز نیست؛همچنین میزان تکثیر در هر سیکل،با دقت حتی یک مولکول قابل ردیابیست.
به این تکنیک، Quantititave PCR یا به اختصار qPCR نیز می‌گویند.
این تکنیک کاربرد گسترده و متنوعی در آزمایشگاه دارد. استفاده از آن هم در تشخیص و هم در تحقیقات پایه ای رایج است. کاربرد آن در صنعت شامل ایمنی مواد غذایی و فساد مواد غذایی و تخمیر،تشخیص ارگانیسم های اصلاح یافته ژنتیکی و کمیت و ژنوتیپ پاتوژن های ویروسی انسانی می‌شود. Real time جهت تشخیص بیماری‌هایی که از روی نوکلئیک اسید مشخص می‌شوند،برای مثال بیماری های عفونی،سرطان و ناهنجاری های ژنتیکی بکار می‌رود. همچنین در آزمایشگاه های میکروبیولوژی ابزاری برای تشخیص بیماری های نوظهور همانند سویه های جدید آنفلوآنزا و ویروس کرونا است.
به طور کلی دو روش برای تشخیص محصولات در real time رایج است:
۱. افزودن رنگ فلوئورسنس SYBR Green به محیط واکنش؛ این رنگ به هر مولکول DNA که بصورت دو رشته ای باشد متصل می‌شود و نور فلوئورسنت از خود ساطع می‌کند. در نتیجه اختصاصی عمل نکرده و ممکن است در اثر اتصال به دایمر پرایمرها یا محصولات غیراختصاصی دیگر،سیگنال تولید کرده و گزارش دقیقی از مقدار محصولات مورد نظر ما بدست ندهد.
۲. افزودن توالی های گزارشگر هدف یا reporter probe؛ این شناساگرها که توالی TaqMan probes نیز خوانده می‌شوند،بصورت اختصاصی عمل کرده و دارای یک رنگ فلوئورسنت متصل به سر ‘۵ و یک بخش quencher (که مهارکننده‌ی رنگ است)متصل به انتهای دیگر خود هستند. توالی این اولیگونوکلئوتید به گونه‌ایست که دو سر آن با یکدیگر مکمل شده و در نتیجه‌ی هیبریدیزاسیون رشته، quencher و رنگ فلوئورسنت در مجاورت هم قرار می‌گیرند و در نتیجه سیگنالی ساطع نمی‌شود.حین انجام PCR، در نتیجه‌ی اثر اگزونوکلئازی ‘۵ به ‘۳ آنزیم Taq polymerase، اتصال بین رنگ فلوئورسنت و quencher شکسته شده و در نتیجه سیگنال آزاد می‌شود.میزان سیگنال های خروجی نشان دهنده‌ی مقدار محصول تولیدی در PCR است که توسط دستگاه خوانده شده و روی صفحه نمایشگر کامپیوتر نمایش داده می‌شود.
نمودار قابل مشاهده،تحت عنوان نمودار Amplification ،دارای سه مرحله می‌باشد:
- مرحله نمایی یا exponential phase که طی آن تکثیر با بازدهی بالا صورت می‌گیرد و در هر چرخه مقدار ماده ژنتیکی دو برابر می‌شود،در نتیجه سیگنال‌های قوی از دستگاه دریافت شده و نمودار به شکل نمایی صعود می‌کند.
- مرحله خطی یا liner phase که بعلت مصرف شدن مقداری از اجزای واکنش، سرعت تکثیر کاهش پیدا می‌کند و شیب نمودار کمتر است.
- مرحله پلاتو یا plateau phase که آنزیم پلیمراز ضعیف یا تخریب شده، مواد واکنش تمام شده و در نتیجه تکثیر توقف کرده و نمودار شکل افقی به خود می‌گیرد.
RT-Real time PCR
برای بررسی بیان یک ژن،نیاز است تا مقدار mRNA موجود در سلول اندازه گیری شود، زیرا مقدار mRNA ساخته شده از روی هر ژن، ارتباط مستقیم با میزان بیان آن ژن است.از آنجا که اساس کار PCR تکثیر DNA است، جهت بررسی بیان ژن لازم است mRNA های مربوط به آن ژن را از سلول استخراج کرده و سپس با reverse transcription، DNA مکمل آن را ایجاد کنیم. این DNAها که cDNA نامیده می شوند، می‌توانند تحت فرایند PCR قرار بگیرند.به این روش،reverse transcription polymerase chain reaction یا به اختصار RT-PCR گفته می‌شود. در واقع RT-PCR نوعی از real time است که نمونه اولیه آن به جای RNA،DNA است.
گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی