سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح علم سیتوژنتیک پرداخته است.

سیتوژنتیک چیست؟

سیتوژنتیک در اصل شاخه ای از ژنتیک است، اما همچنین بخشی از زیست شناسی سلولی / سیتولوژی (زیر مجموعه ای از آناتومی انسان) است، که مربوط به چگونگی ارتباط کروموزوم ها با رفتار سلولی، به ویژه رفتار آنها در هنگام میتوز و میوز است. کروموزوم ها ساختارهای میکروسکوپی موجود در سلول ها هستند و ناهنجاری های مرتبط با آنها منجر به بیماری های ژنتیکی بی‌شماری می شود. تجزیه و تحلیل کروموزومی از لحاظ دقت و وضوح بهبود یافته اند و این منجر به پیشرفت در تشخیص بیماری های مختلف ژنتیکی در همه زمینه های پزشکی شده است. تکنیک های مورد استفاده در سیتوژنتیک شامل کاریوتایپینگ، تجزیه و تحلیل کروموزوم ها توسط G باندینگ، سایر تکنیک های باندینگ سیتوژنتیک و همچنین سیتوژنتیک مولکولی مانند هیبریداسیون فلورسنت درجا (FISH) و هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای (CGH) است.

در دهه 1980 پیشرفت هایی در سیتوژنتیک مولکولی حاصل شد. در حالی که پروب هایی که با رادیوایزوتوپ نشاندار شده بودند از سال 1969 با DNA هیبرید شده بودند، اکنون استفاده از پروب های دارای برچسب فلورسنت صورت گرفت. هیبرید کردن آنها به ترکیبات کروموزومی با استفاده از تکنیک های موجود به عنوان فلورسانس در هیبریداسیون درجا (FISH) شناخته شد. این تغییر به طور قابل توجهی استفاده از تکنیک های کاوشگر را افزایش داد زیرا پروب های دارای برچسب فلورسنت ایمن تر هستند. پیشرفت های بیشتر در بررسی کروموزوم ها منجر به تکنیک‌هایی  شد که به موجب آن‌ها می توان انحرافات در ساختار کروموزومی را با کلون سازی و مطالعه در جزئیات بیشتر مورد بررسی قرار داد.

کاریوتایپینگ چیست؟

تجزیه و تحلیل معمول کروموزوم (Karyotyping) به تجزیه و تحلیل کروموزوم های متافاز که با استفاده از تریپسین باند شده اند و به دنبال آن به گیمسا، لیشمانز یا مخلوطی از این دو متصل شده اند، اشاره دارد. این فرایند الگوهای باندینگ منحصر به فردی روی کروموزوم ها ایجاد می کند. مکانیسم مولکولی و دلیل این الگوها ناشناخته است، اگرچه احتمالاً مربوط به زمان تکثیر و بسته بندی کروماتین است.

آزمایش سیتوژنتیک

انواع روش های باندینگ کروموزوم ها

چندین آزمایش باندینگ کروموزوم در آزمایشگاههای سیتوژنتیک استفاده می شود. باندینگ کویناکرین ( Qباندینگ) اولین روش رنگ آمیزی بود که برای تولید الگوهای باندینگ خاص مورد استفاده قرار گرفت. این روش به میکروسکوپ فلورسانس احتیاج دارد و برای بررسی هترومورفیسم ها کاربردی است اما دیگر به اندازه باندهای گیمسا ( Gباندینگ) مورد استفاده قرار نمی گیرد. در باندینگ G و Q، نواحی غنی از بازهای آلی G و C که درواقع ژن‌های قابل بیان شدن هستند،فشرده تر بوده و بنابراین رنگ کمتری به خود جذب می‌کنند و به صورت روشن دیده می‌شوند در حالی‌ که نواحی غنی از A و T که هتروکروماتینی هستند رنگ بیشتری به خود جذب می‌کنند. باندینگ معکوس یا باندینگ R نیاز به عملیات حرارتی دارد و الگوی معمول سیاه و سفید معمول را که در باندهای G و Q دیده می شود معکوس می کند. (یعنی نواحی فشرده کروموزوم‌ها تیره و نواحی دیگر روشن‌تر دیده می‌شوند).  این روش به ویژه برای رنگ آمیزی انتهای دیستال کروموزومها مفید است. نوع خاصی از رنگ‌آمیزیR ، Tباندینگ نام دارد که برای رنگ آمیزی تلومرها از آن استفاده می‌شود. سایر تکنیک های رنگ آمیزی شامل C-banding و رنگ آمیزی NOR است. این روشهای اخیر بطور خاص بخشهای خاصی از کروموزوم را لکه دار می کنند.  باندینگ C ، هتروکروماتین سازنده، که معمولاً در نزدیکی سانترومر قرار دارد و غنی از A و T است را لکه دار می کند و رنگ آمیزی NOR ، ماهواره ها و ساقه کروموزوم های آکروسانتریک را مشخص می کند.  باندینگ با وضوح بالا شامل رنگ آمیزی کروموزوم ها در طی پروفاز یا متافاز اولیه،قبل از رسیدن به حداکثر تراکم است. از آنجا که کروموزومهای پروفاز و پرومتافاز از کروموزوم های متافاز گسترده تر هستند، تعداد باند های قابل مشاهده برای همه کروموزوم ها از حدود 300 به 450 به 800 می رسد.

مراحل آزمایش سیتوژنتیک

آماده‌سازی اسلاید

سلول های مغز استخوان، خون، مایع آمنیوتیک، خون بند ناف، تومور و بافت ها (از جمله پوست، بند ناف، ویلی کوریونی، کبد و بسیاری از اندام های دیگر) می توانند با استفاده از تکنیک های استاندارد کشت سلول به منظور افزایش تعداد آنها کشت داده شوند. سپس یک مهارکننده میتوزی (کلشی سین) به این محیط کشت اضافه می شود که تقسیم سلولی را در میتوز متوقف می کند و باعث افزایش عملکرد سلول های میتوزی می شود. سلولها سپس سانتریفیوژ می شوند و مهار کننده میتوزی برداشته می شود و با یک محلول هیپوتونیک جایگزین می شود. این باعث می شود گلبول های سفید یا فیبروبلاست ها متورم شوند به طوری که کروموزوم ها در هنگام افزودن به اسلایدها گسترش می یابند و همچنین گلبول های قرمز را لیز می کند.  بعد از اینکه سلولها در محلول هیپوتونیک قرار داده شدند، فیکساتور اضافه می شود.  این ماده سلول ها را می کشد و هسته سلولهای سفید خون باقی مانده را سخت می کند. به طور کلی سلولها به طور مکرر فیکس می شوند تا سلولهای قرمز خون باقی مانده را از بین بروند.  سوسپانسیون سلولی سپس روی اسلایدهای نمونه ریخته می‌شود. پس از این که به اسلایدها چند روز فرصت داده شد و یا این که در یک محیط گرم قرار گرفتند، برای باندینگ و تجزیه و تحلیل آماده هستند.

آنالیز

تجزیه و تحلیل کروموزوم های باند شده به وسیله میکروسکوپ توسط یک متخصص سیتوژنتیک در آزمایشگاه بالینی (CLSp (CG)) انجام می شود. به طور کلی 20 سلول مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند که برای رد کردن موزاییسم در حد قابل قبولی کافی است. نتایج خلاصه می شود و برای بررسی، به یک سیتوژنتیکیست معتبر در هیئت مدیره داده می شود، و با در نظر گرفتن تاریخچه قبلی بیمار و سایر یافته های بالینی ، یک تفسیر نوشته و سپس نتایج گزارش می‌شوند.

تکنیک FISH (fluorscense in situ hybridization)

هیبریداسیون فلورسنت درجا (FISH) به استفاده از پروب نشاندار شده با فلورسانس برای هیبریداسیون با نمونه موردنظر اشاره دارد.این تکنیک از تکنیک‌های سیتوژنتیک مولکولی است و در بررسی ریزحذف‌های کروموزومی کاربرد دارد.

روش انجام تکنیک FISH

برای این کار می توان از پروب‌های تلومری،پروب‌های سانترومری و پروب‌های کل توالی کروموزوم استفاده کرد.؛پس از فیکس شدن کروموزوم‌ها روی لام،آن‌ها را دناتوره میکنند و سپس پروب‌های نشاندار را به لام اضافه می‌کنند.در این حالت پروب‌ها به ناحیه مکمل خاصی در کروموزوم که برای آن طراحی شده‌اند می‌چسبند‌ و بنابراین برای بررسی این نقاط خاص بکار می‌روند.(برای مثال از پروب‌های سانترومری برای بررسی آنیوپلوئیدی می‌توان استفاده کرد).

کاربردهای FISH

FISH را می توان در موارد زیر نیز انجام داد:

اسمیر مغز استخوان

اسمیر خون

آماده سازی بافت تعبیه شده با پارافین

آنزیم‌های جدا شده از نمونه های بافتی

مغز استخوان کشت داده نشده

آمنیوسیتهای کشت‌ داده نشده

آماده سازی سیتوسپین

آماده سازی اسلاید

 آنالیز

تجزیه و تحلیل نمونه های FISH توسط میکروسکوپ فلورسانس توسط متخصص آزمایشگاه بالینی سیتوژنتیک انجام می شود. به طور کلی برای انکولوژی تعداد زیادی سلول اینترفازی (به طور کلی بین 200 تا 1000 سلول) شمارش شده و نمره می گیرند. برای مشکلات مادرزادی معمولاً 20 سلول متافاز نمره داده می شود.

تکنیک CGH

تکنیکی برای شناسایی حذف و اضافه شدگی های ژنتیکی ست و کاریوتایپ مولکولی نامیده می‌شود. این تکنیک بر اساس هیبریداسیون ژنوم است و به خصوص در بررسی ناهنجاری های مادرزادی به کار می رود. همچنین در شناسایی مشکلات رفتاری و ذهنی که علت‌های ناشناخته دارند و مشکلاتی همچون تشنج و صرع به کار می‌رود. CGH نیازی به انجام کشت سلولی و مقدمات لازم برای سایر تکنیک ها ندارد و همچنین نسبت به تکنیک هایی همچون FISH جامع تر است؛ به این دلیل که از تکنیک FISH زمانی استفاده می شود که علائم بالینی یک بیماری بروز پیدا کند و در نتیجه قسمت خاصی از ژنوم که مربوط به آن بیماری است بررسی می شود، اما در CGH طیف وسیعی از ژن ها به طور همزمان قابل بررسی هستند.

روش انجام CGH

اساس این تکنیک مقایسه نمونه ژنوم مورد نظر با یک ژنوم کنترل است؛ در این روش نمونه DNA مورد نظر با DNA کنترل هر دو با رنگ های متفاوت نشان دار می شوند و پس از هیبریداسیون آنها سیگنال های رنگی بدست آمده با یکدیگر مقایسه می‌شوند و تفاوت های بین نمونه ها به شکل پیک های رنگی قابل مشاهده است. برای مثال برای بررسی فعالیت یک سلول سرطانی از CGH استفاده می‌شود و نواحی‌ای از ژنوم که فعالیت بیشتری در سلول سرطانی دارند شناسایی خواهند شد.

خلاصه: سیتوژنتیک در اصل شاخه ای از ژنتیک است که مربوط به چگونگی ارتباط کروموزوم ها با رفتار سلولی است. ناهنجاری های مرتبط با کروموزوم ها منجر به بیماری های ژنتیکی بی‌شماری می شود و در نتیجه تجزیه و تحلیل کروموزومی منجر به پیشرفت در تشخیص بیماری های مختلف ژنتیکی در همه زمینه های پزشکی شده است. تکنیک های مورد استفاده در سیتوژنتیک شامل کاریوتایپینگ، تجزیه و تحلیل کروموزوم ها توسط تکنیک های باندینگ سیتوژنتیک و همچنین سیتوژنتیک مولکولی مانند هیبریداسیون فلورسنت درجا (FISH) و هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای (CGH) است.

تفاوت روش های مختلف باندینگ کروموزومی در چیست؟

تکنیک FISH  چگونه انجام می گیرد و آنالیز آن به چه صورت است؟

در صورت تمایل مقاله SDS PAGE را مطالعه فرمایید.

منبع:  Geneme.gov , Wikipedia , Britannica

لیلا تنهایی