سایت ویستاژن در این مقاله به  توضیح وجه پنهان بیوتکنولوژی میکروجلبک، پرداخته است.

یک بستر پالایشگاه زیستی هتروتروف به تولید چربی غنی از امگا-3 دست یافت.

 

چکیده مقاله میکروجلبک

روغن های میکروبی مواد اولیه تجزیه پذیر انرژی زیستی در نظر گرفته شده اند چون در زمین زراعی،آب شیرین،تنوع چشم انداز زیستی طبیعی با محصولات غذایی رقابت نمی کنند.روغن های میکرو جلبکی همچنین می توانند در کنار تولید سوخت زیستی مثل تولیدات دارویی،مواد مغذی،آرایشی و بهداشتی و صنایع غذایی.

اسیدهای چرب اشباع نشده (PUFA ها) که از میکروجلبک دارای خواص روغنی بدست آمده اند، بیش از دیگر منابع PUFA ها فایده نشان می دهند.در مقایسه با روغن ماهی ها، بی بو هستند و مستقل از موجودی ماهی هستند. میکروجلبک های هتروتروف می توانند از بستر های کم هزینه استفاده کنند.مثل استفاده از ضایعات یا باقی مانده های آلی کربن دار که توان تولید همزمان PUFA ها و چربی های دیگری را دارند که بعدا می توانند به انرژی زیستی تبدیل شوند .این کار برای ترکیب گرما و نیرو (CHP) یا سوخت های زیستی مایع  صورت می گیرد تا سیستم حمل و نقل یکپارچه شوند.این مقاله به بررسی استراتژی های گوناگونی می پرداز که اخیرا برای کشت و فرایند های بیشتر میکروجلبک های هتروتروف برای چربی ها، با تاکید بر ترکیبات غنی از امگا-3، استفاده می شود.همچنین این مقاله،اهمیت یک فرایند به هم پیوسته را برجسته می کند.رویکردی که مبتنی بر استفاده از اجزای کم هزینه مربوط به پالایشگاه زیستی زیست توده میکروجلبک است و با هدف شناسایی بهترین روش پایداری است تا برای کل سیستم یکپارچه اعمال شود.

میکرو جلبک چیست؟

میکروجلبک ها طیف گسترده ای از ترکیبات ارزشمند مثل کربوهیدرات ها، پروتئین ها، رنگدانه ها و چربی ها تولید می کنند. در حال حاضر، آن ها به واسطه ظرفیت تولید محصولات با ارزش افزوده بالا قابل فروش از مواد کم ارزش به عنوان مواد اولیه، مشارکت کنندگان بالقوه در ترقی اقتصاد زیستی جهانی در نظر گرفته شده اند.

علاوه بر این میکروجلبک ها می توانند روی بستر های کم هزینه مثل محصولات جانبی یا پساب های صنعتی رشد کنند. و منجر به حذف آلودگی وهمزمان تولید زیست توده با سود تجاری می شوند. از عوامل اصلی دوام این مواد اولیه ،فصلی نبودن، وابسته نبودن به شرایط آب و هوایی ، بی نیازی از زمین زراعی برای قرار گیری و عملکرد بیوراکتور هاستمیکروجلبک های روغنی بیش از 20 درصد وزن خشک خود را روغن درون سلولی تولید می کنند که می تواند به بیودیزل (سوخت ارگانیک با آلایندگی کم ) تبدیل شود .با این حال بیودیزل به وجود آمده از میکروبها ازجمله میکروجلبک ها، هنوز به لحاظ اقتصادی پایدار نیست زیرا هزینه تولید آن با هزینه تولید سوخت فسیلی قابل مقایسه نیست .یک راه کاهش هزینه ها، استفاده از بستر کم هزینه در محیط کشت میکروب یعنی پساب های صنعتی و خانگی، محصولات جانبی و پس مانده ها است. رویکرد دیگری نیز بر پایه میکروجلبک ها، برای فرایند های زیستی اعمال شده است که بر اساس مفهوم کلی پایشگاه زیستی است. این رویکرد می تواند از محصولات متنوعی که توسط میکروجلبک ها سنتز می شوند، بهره ببرد. به این ترتیب ممکن است روند کلی اقتصاد بسیار بهبود یابد. چون زیست توده ها با ارزش افزوده بالا ، مانند PUFA ها، کاروتنوئیدها، پروتئین ها و… ممکن است به تقویت تولید سوخت های زیستی جلبکی کمک کند. PUFA ها نقش مهمی در سیالیت غشا، متابولیسم سلولی حمل و نقل و به عنوان ایکوزانوئید دارند. فواید PUFA امگا-3 ها در سلامت انسان شناخته شده است که باعث جلب توجه صنایع دارویی، مواد مغذی، آرایشی ، غذایی و خوراک شده است. PUFA امگا-3 ها اجزای مهم سیستم عصبی و مغز هستند و در چندین نوع عملکرد عصبی مثل نورون زایی ، انتقال عصبی و محافظت در برابر صدمات مغذی ناشی از تنش اکسیداتیو نقش مهمی دارند. پیش ماده PUFA امگا-3 ها ، آلفا لینوئیک اسید (18:3ω3) است که می تواند به ایکوزانوئید اسید (EPA, 20:5 ω5)، دوکوزاپنتانوئیک اسید (DPA,22:5 ω3) و دوکوزوهگزانوئیک اسید (DHA,22:6 ω 3) تبدیل شود اما نرخ این تبدیل ها بسیار کم است.در نتیجه PUFA امگا-3 ها باید از طریق رژیم غذایی مصرف شود. به ویژه زنجیره بلند DHA و EPA در درمان بسیاری از بیماری های انسانی مانندسرطان، تصلب شریان، آلزایمر، روماتیسم مفصلی، پسوریازیس نقش دارند. DHA یک جزء اساسی مغز و سیستم اعصاب است.بعلت ایفای نقش بسیار مهم در نمو مغز نوزاد یک اسید چرب حیاتی بین PUFA امگا-3 ها است. به دنبال گزارش های تحقیقاتی که ادعا می کنند نوزادان تغذیه شده با خوراک فرمولی (شیر مصنوعی) در مقایسه با نوزادان تغذیه شده با شیر مادر،مقدار کمتری از DHA و اسیدآراشیدونیک دارند(ARA,20:4 ω 6)،DHA محبوبیت بیشتری بدست آورده است.این واقعیت توضیح می دهد که افزایش بازار جهانی DHA مبنی بر میکروجلبک ها، منوط به رشد آگاهی عمومی در مورد مراقبت های بهداشتی و بیماری های مزمن است.این آگاهی منجر به گسترش برنامه ها و مقررات DHA  به نفع استفاده از محصول در فرمولاسیون مربوط به نوزادان شده است.منابع اصلی  PUFA امگا-3 ها ،از جمله DHA و tEPA گونه های ماهی های چربی دار مثل شاه ماهی،ماهی اسقومری، ساردین، من هارن وسالمون  آزاد است. با این حال، سهام جهانی در حال کاهش است و نمی تواند یک منبع پایدار برای اسیدهای چرب امگا-3 فراهم کند.از سوی دیگر،کیفیت روغن ماهی ها متنوع است و به گونه ی ماهی،فصل و محل صید بستگی دارد.به علاوه روغن های ماهی بویی نامطبوع بوجود می آورند و ممکن است توسط پلی کلروبین فنیل ها (PCBs) یا فلزات سنگین آلوده شده و آن ها را برای مشارکت داشتن در مواد خوراکی و خوراک،یعنی در فرمولاسیون نوزادان یا استفاده در فرمولاسیون دارویی، نامناسب کنند. علاوه بر این، از آنجا که روغن ماهی دریایی ترکیبی پیچیده از اسیدهای چرب با تنوع در طول و درجه اشباع است، ممکن است پیش از مصرف،تصفیه گران DHA نیاز باشد. روغن های حاصل از گیاهان اصلاح ژنتیکی شده و یکروارگانیسم ها دو جایگزین بالقوه روغن ماهی هستند(با اینکه مقدار PUFA امگا-3 ها می تواند در دومی بیشتر باشد). اگرچه گیاهان تراریخته فواید زیادی دارند اما تولید آن ها به شرایط فصلی و آب و هوایی و همچنین دسترسی به اراضی کشت بستگی دارد.به علاوه، نگرانی های عمومی در رابطه با کشت محصولات تراریخته در اکوسیستم های باز وجود دارد. به این ترتیب زیست توده میکروجلبک منحصرا برای استخراج و تمیز کردن PUFA  های تکی مناسب است، چون این ماده عاری از کلسترول ،آلودگی (مثل فلزات سنگین، پلی کلروبی فنیل ها و …) است و مزه خوبی دارد. در حال حاضر، کمتر از 2 درصد مصرف DHA و EPA انسان را نشان می دهند. اما سهم آن به دلیل چندین ویژگی اجتماعی از جمله رضایتمندی زیست محیطی ،وجود آلاینده های ناشی از اقیانوس، طبیعت گیاهی آن، همچنین امکان تولید آن در شرایط پاک و حلال در حال افزایش است. با این حال، روغن های بر پایه میکروجلبک ها در نتیجه تخمیر و تجدید حیات در حال حاضر از روغن های ماهی گران تر هستند. بنابراین محصول بر اساس میکروجلبک روغن های غنی شده از DHA و epa گرچه با قیمت بالا اما می تواند تقاضای بسیاری برای این مواد مغذی آماده کند. میکرو جلبک های اتوتروف از کربن دی اکسید و نور به عنوان منابع کربن و انرژی استفاده می کنند و بطور میانگین به ازای هر کیلوگرم میکروجلبک خشک 1.83 کیلوگرم کربن دی اکسید را ترسیب می کند. درحالی که میکروجلبک های هتروتروف از کربن آلی به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده می کنند.پیدا کردن منبعی که طی رشد هتروتروف کربن دی اکسید منتشر کند،همچنان چالش برانگیز بوده اما یکی می توان تخمین زد 0.1 تا 4 کیلوگرم کربن دی اکسید به ازای هر کیلوگرم میکروجلبک خشک.

کشت میکروجلبک های اتوتروف به دلیل مصرف co2 و تولید o2 میزان انتشار گازهای گلخانه ای ((GHG را کاهش می دهد و می تواند از آب غیر قابل شرب و زمین غیرقابل کشت استفاده کند که این مزیت ها نسبت به کشت های هتروتروف است.

ارزان ترین سیستم های کشت میکروبی فتوتروف، از جمله جوی آب است.همچنین می تواند در خاک های تخریب شده ساخته شود مثلا در زمین های حاشیه ای و غیر کشاورزی که باعث مراقبت در استفاده از زمین های ارزشمند و مناطق تولید محصول می شود.با این حال کشت های فتوتروف محدودیت های متنوعی را نشان می دهند:1. تامین آب مداوم و تمیز مورد نیاز است 2.ممکن است در کشت،انتشار نوری ضعیف رخ دهد که با ضخامت شدت می یابد، اگر هنگامی که کشت شدید باشد، باز هم تشدید شود باعث سایه زنی خود و در نتیجه باعث محدودیت در نور برای سلول ها می شود که ناچارا به سمت محصولات زیست توده ای کم هدایت می کند  3.آلودگی آسان، رقابت، شیوع و شکار توسط ارگانیسم های دیگر، حفظ خلوص کشت های میکروجلبک. 4.وابستگی به فصل و وضعیت آب و هوا و 5. دشواری در برداشتن زیست توده میکروجلبکی به علت غلظت کم .برای غلبه بر این محدودیت ،ممکن است از فتوبیورآکتورها (PBR) استفاده شده که موجب توسعه یافتن کشت های میکروجلبکی در شرایط کنترل شده می شود و امکان حفظ کشت های خالص با هدف تولید محصولات دارویی را ایجاد می کند.با این حال ،این سیستم ها همچنین اشکالاتی مثل سرمایه گذاری اولیه بالا در زیرساخت ها و نیاز به نگهداری مداوم ایجاد می کنند. همچنین هنگام استفاده از محیط های بزرگ کشت، برقرار کردن انتشار نوری موثر در سرتاسر محیط کشت کار دشواری است که اگر زیست لایه ها روی سطوح  PBR ایجاد شده باشند، این دشواری تشدید می شود که ناچارا به شرایط محدودیت نور منجر می شود.علاوه بر این،کشت میکروجلبک های اتوتروف در PBR  قرار گرفته در عرض های جغرافیایی بالاتر،نیازمند سیستم های گرمایشی و زیربناهای گران گلخانه ای برای حفظ بازدهی بالا دارد که باعث افزایش هزینه های فرایند می شود. تخمین زده می شود 33درصد فرایند اتوتروف ،طی حرکت از استوا به 40 درجه N  ترمیمی ایجاد می کند. بنابراین میکروجلبک های هتروتروف ممکن است منحصرا برای کشور های قرار گرفته در بالای عرض جغرافیایی مثل کشور های اروپایی ،جالب توجه باشد.به علاوه کشت میکروجلبک های هتروتروف در ظروف تخمیر معمولی تحت شرایط کاملا  آزنیک (فاقد موجودات ریز)و عملکردی انجام می شود ، تا زمانی که بیرون از ظروف انجام می شود نسبت به کشت های اتوتروف، کمتر مستعد ابتلا به آلودگی های میکروبی باشند.

در نتیجه شرایط هتروتروفی می تواند غلظت زیست توده میکرو جلبکس را در مقایسه با شرایط فتوتروفی که منجر به تولیدات زیست توده و چربی های بیشتر شود، بهبود ببخشد.

علاوه بر این در بیشتر موارد سیستم های کشت هتروتروف، نسبت به کشت اتوتروف، ارزان تر بوده و نگهداری آن ها در مقیاس بزرگ آسان تر است و همچنین امکانات برای ایجاد آن ها ساده تر است. در این مقاله به بررسی رویکردهای مختلفی که اخیرا برای کشف میکروجلبک های هتروتروف به منظور چربی ها، با تاکید بر ترکیبات امگا-3 استفاده می شود،می پردازد. تاکید بر اهمیت یک رویکرد یکپارچه مبتنی بر استفاده از یک پالایشگاه چند محصول زیستی میکروجلبک که از تمام  اجزای میکروجلبک بطور بهینه استفاده می کند،به منظور دستیابی به یک فرایند پایدار.

2.متابولیسم هتروتروف-جذب کربن و سنتز لیپید

در متابولیسم هتروتروفی،کربن آلی جذب شده توسط ماکروجلبک به همان شیوه مشابه به باکتری، تجزیه می شود. کربن آلی، برای تولید انرژی توسط میکروجلبک های هتروتروف مصرف می شوند. مولکول های پیچیده مانند نشاسته می توانند از طریق مسیر Embden Mayerhoff Parnas (مسیر EMP یا گلیکولیز) یا مسیر پنتوز فسفات (PPP) متابولیزه شوند و NADH و ATP تولید  کنند. در اولین مسیر، نشاسته برای اولین بار به گلوکز شکسته می شود که در نهایت فسفریله شده و به مسیر EMP هدایت می شود. محصول نهایی این مسیر، پیروات، در سیتوزول تشکیل می شود و از تبدیل گلیسیرالدئید -3-فسفات ، که قبلاً به سیتوزول صادر شده است، حاصل می شود. به طور کلی، ارگانیسم های روغنی وابسته به AMP ایزوسیترات دهیدروژناز، آنزیمی از چرخه TCA هستند که کاتالیزور دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو ایزوسیترات هستند. در شرایط محدود کننده نیتروژن، آدنوزین مونوفسفات (AMP) دامیناز به مونوفسفات اینوزین (IMP) و آمونیاک تبدیل می شود که به سلول های گرسنه ازت ارائه می شود و باعث کاهش سطح AMP می شود. متابولیسم ایزوسیترات در نتیجه انباشت و تعادل آن با سیترات در میتوکندری مسدود شده است(شکل1). مقدار اضافی سیترات از میتوکندری به سیتوزول منتقل می شود. ATP: سیترات لیاز، یک آنزیم کلیدی در سلول زایی، سیترات موجود در سیتوزول را شکسته و در نتیجه، سنتز استیل CoA برای تولید اسیدهای چرب ایجاد می کند. این مسیر تقریباً در سنتز اسیدهای پالمیتیک(16: 0) یا استئاریک (18: 0) به پایان می رسد. برای سنتز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی ، از جمله سنتز  هاPUFA ،افزایش پیاپی طول مورد نیاز است. فقط قارچ ها و جلبک ها توانایی سنتز لیپیدهای حاوی بیش از 20٪ PUFA ها (نسبت وزنی\وزنی به کل اسید های چرب) را دارند، که آنها را برای این هدف جذاب می کند.

شکل1. جذب کربن و سنتز لیپیدها در میکرو جلبک های هتروتروف تحت شرایط محدودیت نیتروژن.

توانایی موجودات زنده یوکاریوتی دارای خواص چربی، در مقایسه با گونه های غیر روغنی ،در تجمع مقدار زیاد لیپیدها ،از نظر بیوسنتز اسید چرب متفاوت نیستند. با این حال  تهیه مداوم استیل-CoA و NADPH،  در شرایط محدودیت مواد مغذی به استثنای شرایط کمبود کربن، برای تولید اسید چرب بواسطه یک امگا-اکسیداسیون معکوس باید تامین باشد.

جلبک های هتروتروف پرورش یافته تحت شرایط هوازی نفس می کشند، که همانطور که در بالا گفته شد با اکسیداسیون کامل گلوکز به کربن دی اکسید از طریق EMP،PPP و چرخه تری کربوکسیلیک اسید (چرخه TCA) اتفاق می افتد و ATP از طریق فسفوریلاسیون اکسیداتیو تولید می شود. بنابراین، کشت جلبک هایی که روی منابع کربن مانند گلوکز رشد می کنند، برای بدست آوردن بهره وری زیست توده زیاد، به هوادهی مؤثر محیط کشت ها نیاز دارند ، زیرا اکسیژن برای تنفس لازم است. هنگام استفاده از میکرو جلبک های هتروتروف برای تولید لیپیدها، به منظور پایداری از نظر اقتصادی و محیط زیستی، مهم است که گونه های منتخب:1. می تواند در محیط های کشت استریل نسبتاً ارزان رشد کنند،2. توانایی مقاومت در برابر تنش های هیدرودینامیکی موجود در تخمیرهای معمولی را نشان می دهد،3. سازگاری در محیط زیست سخت و 4.شرایط سخت را نشان می دهد،5. توانایی استفاده از انواع منابع کربنی آلی از جمله ضایعات زیست توده لیگنوسلولزی و سایر مواد را نشان می دهد.

3.میکروجلبک های هتروتروفی دارای خواص روغنی برای ترکیبات امگا تلاش می کنند.

جدول شماره 1 نشان دهنده بیشترین تلاش استفاده از میکروجلبک های هتروتروف یا شبه میکروجلبک است که در پیشینه ی تحقیق (پژوهش ها) برای تولید DHA و EPA معروف است و همچنین بعنوان منابع کربنی کم هزینه که برای تولید ترکیبات ω-3 استفاده شده اند.

در حال حاضر، بیشترین میکرو جلبک ها برای تولید روغن جلبکی غنی از ω-3 و زیست توده اعضای دریایی از خانواده های Thraustochytriacea و Crythecodiniacea هستند که در اقیانوس ها وجود دارند. Crypthecodinium یک سرده از  خانواده Crypthecodiniaceae است. Thraustochytrids شامل سرده های Aurantiochytrium ، Schizochytrium و Ulkenia است. این هتروتروف ها می توانند مقدار بالای روغن (تا 50-77٪ بر اساس وزن خشک) را نشان دهند که عمدتا از تری گلیسرول ها (TAG) غنی از DHA تشکیل شده است.

جدول 1 . میکرو جلبک های هتروتروف و شبه میکرو جلبک هایی که ترکیبات امگا-3 و همچنین منابع کربنی را که در فرمولاسیون محیط های کشت استفاده شده اند، تولید می کنند.

  1. تأثیر شرایط عملیاتی بر رشد میکروجلبک ها ، لیپیدها و تولید DHA

4.1. ترکیبات حد واسط

منبع کربن گران ترین مؤلفه محیط کشت تخمیر است. در اواخر دهه 1990 و اوایل 2000، بسترهای کربنی منفرد مانند گلوکز ، اتانول ، استات و گلیسرول برای رشد میکرو جلبک های هتروتروف برای ترکیبات امگا3 استفاده شده است.مطالعه رشد دسته ای 30772  C. cohnii در محیط کشت های شامل 25 گرم\لیتر، 50گرم\لیتر،75گرم\لیتر گلوکز و نشان داد که حداکثر غلظت زیست توده در بالاترین غلظت گلوکز بدست آمد، در حالی که نرخ رشد خاص در غلظت گلوکز بالاتر از 25گرم\لیتر کاهش یافته است. توجه به در نظر گرفتن این اثر مهاری غلظت بالای  گلوکز  بر رشد C. cohnii  هنگام رشد این میکرو جلبک ها در سیستم های دسته های تغذیه شده به منظور جلوگیری از مهار بستر مهم است. با وجود اینکه این منابع کربنی باعث افزایش تولید چربی و DHA می شوند،گران قیمت هستند(قیمت مواد به ازای هر کیلوگرم: گلوکز 16 €،اتانول 1.82€، اسیداستیک 0.45€) و بودن اتانول و اسید استیک برای حمل و نقل خطرناک و دشوار است. سایر اجزای گران قیمت یک محیط کشت معمولی ترکیبات نیتروژن است. منابع نیتروژن معدنی ( مثل ، آمونیاک ، اوره) قابل استفاده هستند، اما آن ها فاقد مواد معدنی کمیاب و سایر مواد مغذی (یعنی ویتامین ها) هستند که برای رشد میکرو جلبک ضروری بوده و در منابع پیچیده نیتروژن مانند پروتئین های تخریب شده مثل عصاره مخمرو  پپتونهای سویا وجود دارند. با این حال این مواد مغذی گران هستند(قیمت مواد مغذی به ازای هر کیلوگرم: عصاره مخمر 35.4€ و پپتون های سویا 7.25€). افزایش آگاهی عمومی نسبت به لزوم تحقق قوانین اقتصاد دایره ای و همچنین لزوم استفاده از بسترهای کم هزینه به عنوان مواد اولیه برای کاهش هزینه های زیست فرآوری، باعث جستجو در ضایعات\محصولات جانبی\پساب ها شده است تا به عنوان مواد مغذی در فرمولاسیون محیط های کشت برای رشد میکروب ها استفاده شود. در حقیقت، در سال های اخیر، بسترهایی مانند هیدرولیز زباله های مواد غذایی، شربت ذرت خوشه ای شیرین، شربت پالپ خرنوب، هیدرولیز کنجاله کانولا مخلوط شده با شیره خام(0.91€ به ازای هر کیلوگرم)، آب پنیر مخلوط شده با عصاره دم کرده ذرت، آب هیدرولیز شده سیب زمینی  و عصاره دم کرده  ذرت(0.65 € به ازای هر کیلوگرم) در فرمولاسیون محیط های کشت برای تولید ترکیبات امگا 3 از میکرو جلبک های هتروتروف استفاده شده است(جدول1). با این حال ، با وجود حجم  بالای پروتئین، کربوهیدرات ها و مواد معدنی موجود در این بسترهای پیچیده ، آن ها نمی توانند به طور مستقیم توسط اکثر میکروارگانیسم ها جذب شوند. با این وجود، این بسترها می توانند ، هنگامی که آن ها تحت مراحل قبل از مداوا قرار می گیرند، برای میکروارگانیسم ها در دسترس باشند تا مواد مغذی مورد نیاز میکروب ها آزاد شود.برای مثال گونگ و … .بکار گیری یک تخمیر در حالت جامد و اتولیز قارچی با استفاده از سویه های قارچی Aspergillus oryzae ، Penicillium oxalicum و Neassospora crassa برای ایجاد هیدرولیز کنجاله  کلزا (RMH) استفاده کرد. سپس، RMHhc  به عنوان محیط رشد برای رشد میکروجلبک C. cohnii جهت تولید DHA استفاده شد.مندز و… . با افزودن آب مقطر (با نسبت 2به1)به باقی مانده پالپ خرنوب ،یک شربت پالپ خرنوب با مقدار زیادی از حاصل قند های تلخیص به دست آورد. سپس سوسپانسیون بدست آمده فشرده وچلانده شد، مایع شناور بر سطح سانتریفیوژ شد و جزء مایع به منظور پیشبرد هیدرولیز ساکارز برای به دست آوردن گلوکز و فروکتوز ، به pH 2 تبدیل(اسیدی) شد.

 

میکرو جلبک ها

4.2. طریقه کشت میکروجلبک 

از جدول 1 مشاهده می شود که از الگوهای منظم دسته ای و دسته ی تغذیه ای برای تولید میکروجلبک های هتروتروف برای تولید لیپیدها استفاده شده است. فرآیندهای تخمیر روغن جلبک باید ترجیحاً در دو مرحله انجام شود: در اولین مرحله از رشد فعال، شرایط مواد مغذی زیادی باعث تکثیر سلولی می شود و تولید لیپیدها را کم نگه می دارد زیرا کربن به سمت تقسیم سلولی هدایت می شود. در مرحله دوم ، کمبود مواد مغذی، اغلب نیتروژن ، همزمان با کربن مداوم عرضه شده در در تخمیر ،رشد و تقسیم سلولی متوقف می شود و انرژی که قبلاً برای سنتز DNA / RNA و دیگر پروتئین ها اندوخته می شد،برای تولید TAG های غنی از DHA تغییر می یابد. حفظ شرایط  کربن مازاد  در محیط آبی نه تنها برای تقویت سنتز چربی، بلکه برای جلوگیری از مصرف درونی از لیپیدهای ذخیره داخلی ضروری است. سایر راهکارهای تحریک لیپیدها بر روی میکرو جلبک های هتروتروف، مانند افزایش شوری، استفاده شده است. با این حال، باید توجه داشت که شرایط تنشی که باعث تحریک  سنتز لیپیدهای میکروبی می شوند، معمولاً غلظت زیست توده میکروبی کم را به همراه دارد. علاوه بر این، گاهی اوقات این شرایط باعث ایجاد آسیب اکسیداتیو PUFA ها می شود و به پراکسیداسیون لیپیدها واکنش ناخواسته ای می دهد که باعث تجزیه این چربی ها می شود و آنها را برای کاربردهای تجاری مناسب نمی کند. بنابراین، تولید سویه های جدید که همزمان لیپیدهای زیادی تولید می کنند و مقاومت  آنتی اکسیدانی را نشان می دهند ، مد نظر است. تکامل آزمایشگاهی تطبیقی (ALE) توسط سان و… به منظور افزایش تولید DHA Shizochytrium ساخته شد. نویسندگان از دو رویکرد متفاوت برای ALE استفاده کرده اند: درجه حرارت پایین و شوری زیاد برای بهبود مقاومت آنتی اکسیدانی میکروجلبک های دریایی.

4.3.اکسیژن محلول

تولید لیپیدهای میکروبی، به ویژه ترکیبات امگا 3 ، به میزان زیادی اکسیژن محلول (DO) در محیط کشت براث نیاز دارد، تا بتواند تشکیل پیوندهای دوتایی در اسیدهای چرب نهایی امگا-3 را افزایش دهد، اما درباره این موضوع اختلاف نظر وجود دارد. نیاز اکسیژن به گونه‌های میکروجلبک ها بستگی دارد و این ماده مغذی در مرحله اولیه تولید زیست توده نقش اساسی دارد. برای اطمینان از شرایط کافی بودن اکسیژن در کشت های میکروبی، باید از میزان همزنی کافی و / یا هوادهی کافی استفاده شود، زیرا این شاخص ها میزان اکسیژن موجود در محیط کشت براث را تعیین می کنند. با این حال، باید احتیاط کرد زیرا برخی از گونه های میکرو جلبک ، به ویژه  dinoflagellateها، نسبت به تنش برشی حساس هستند، اگرچه در متون گذشته درباره حساسیت برشی سلول های C. cohnii ، نظرات مختلفی می توان یافت. وانگ و همکاران تحمل مقاومت به تنش برشی گونه های مختلف میکروجلبک ها (هاپتوفیت ها، جلبک های قرمز ، دیاتوم ها و dinoflagellate) را تجزیه و تحلیل کردند و نتیجه گرفتند که بستر های dinoflagellateها حساس ترین میکروارگانیسم ها هستند. در طول کشت های میکروجلبکی، مهم ترین شاخص های مسئول تنش برشی، تلاطم، اندازه جریان گردابی و گرانروی است که ممکن است بر چندین عملکرد و بخش های  سلول تأثیر بگذارد. در واقع همانطور که قبلاً توسط یونگ و همکارانش  در اثری که  بطور هماهنگ تأثیر تحریک مکانیکی در پیشرفت چرخه سلولی سلول های C. cohnii را مطالعه کرده اند،  نشان داده شد، چرخه سلولی نیز ممکن است توسط تنش برشی مختل شود. نویسندگان دریافتند وقتی سلول ها در 150 دور در دقیقه رشد می کردند ، تعداد زیادی از سلول ها در مرحله G1 متوقف می شدند. با این حال ، با قطع تحریک ، سلول ها به طور معمول چرخه سلولی را از سر می گیرند. از طرف دیگر ، هو و همکاران مشاهده کردند، وقتی سلول های C. cohnii تحت فشار هوا از 0 تا 100 (ml/min) رشد کنند، هیچ کافتندگی  سلولی رخ نمی دهد، با این حال در بالاتر از     50(ml/min) صدمه به  flagella و در نتیجه از دست دادن تحرک مشاهده شد. علاوه بر این ، هنگامی که گردش قطع شد، تحرک بازیابی شد. علاوه بر این ، با استفاده از فلوسیومتری در رابطه با روش رنگ آمیزی پریمیدیوم یدید، در هر دوdinoflagellate هتروتروف C. cohnii و dinoflagellate فتوسنتزی Heteroscapsa triquetra،یونگ و همکارانش اثرات همزن مکانیکی بر پیشرفت چرخه سلولی را مطالعه کرده و مشاهده کردند تحریک مکانیکی باعث مهار چرخه سلولی گذرا در مرحله G1 می شود. اثرات مثبت تحریک بر رشد C. cohnii 30772 و تولید لیپیدها نیز گزارش شده است. د سوواف و همکاران پیشرفت در تراکم نوری C. cohnii  را گزارش کردند و این گزارش توسط قرائت 400٪   آزمایش لرزش بالن است (50 میلی لیتر دربالون 250 میلی لیتر)، هنگامی که سرعت لرزش از 50 به 100 دور در دقیقه افزایش یافته بود و مطالعات میکروسکوپی هیچ گونه اثرات مضر در 100 دور در دقیقه،  در مقایسه با 50 دور در دقیقه، بر فیزیولوژی سلول نشان نداد،صفدار و همکاران.،به موازات اینکه C. cohnii ATCC 30555 از 150 به 450 دور در دقیقه افزایش یافت، افزایش کمی در زیست توده و تولید DHA مشاهده شد. در هر صورت ، هنگام تولید لیپیدهای میکروجلبکی از طریق متابولیسم هتروتروفیک، نیاز به اکسیژن سلولی به دقت در نظر گرفته می شود ، به ویژه در مرحله رشد فعال میکرو جلبک ها ، که مانع از آسیب دیدگی سلولی می شود ، برای جلوگیری از اختلال در رشد سلولی. در هر صورت ، هنگام تولید لیپیدهای میکروجلبکی از طریق متابولیسم هتروتروفی، نیاز اکسیژن سلولی ، به ویژه در مرحله رشد فعال میکرو جلبک ها، باید به دقت در نظر گرفته شود.مطلوب بودن کنترل آسیب سلولی، برای جلوگیری از اختلال در رشد سلول است. Guo و همکاران طراحی بیوراکتور جدیدی را فراهم می کنند که یک منبع اکسیژن زیاد را در ترکیب با یک استراتژی کنترل اکسیژن محلول برای بهبود تولید DHA میکروجلبکی ایجاد می کند.پروانه تیغه غشایی متخلخل استفاده شد و باعث بهبودی هوادهی و افزایش DO که طراحی بیوراکتور جدید را تشکیل می دهد. به گفته نویسندگان ، این بیوراکتور جدید می تواند به طور قابل توجهی غلظت DO را در مقایسه با یک بیوراکتور معمولی افزایش دهد همچنین تکثیر سلولی و تجمع لیپیدها را بدون آسیب سلولی تسهیل می کند.

4.4. pH محیط کشت

pH محیط کشت بر تولید زیست توده میکروجلبکی و DHA تأثیر می گذارد. pH بهینه برای زیست توده و تولید لیپید بستگی به کشش میکروجلبک دارد. طبق گفته های گونگ و همکاران pH بهینه برای رشد C. cohnii ATCC 30556 ، تولید چربی و     DHA 7.2 بود. با این حال ، Safdar و همکاران. pH بهینه 6.5 را برای رشد C. cohnii ATCC 30556 ، تولید چربی و تولید DHA گزارش کردند. با این وجود ، هر دو نویسنده دریافتند که مقادیر pH پایین تر از 5.0 یا بالاتر از 9.0 برای رشد C. cohnii نامطلوب بودند.

به این دلیل است که سیستم های آنتی پورت  k^+/ پروتون و 〖Na〗^+/ پروتون و همچنین تنظیم پمپ های پروتون اولیه سلولی ، وظیفه حفظ pH درون سلول را بر عهده دارند، که نیازمند پتانسیل الکتریکی در سراسر غشای سلولی است. به این ترتیب، هنگامی که سلول های C. cohnii با pH  دور از pH مطلوب رشد می کنند ، سلول ها برای حفظ pH درون سلولی فیزیولوژیکی نرمال ، انرژی را مدیریت می کنند، که منجر به تولید زیست توده و کاهش سرعت رشد ویژه می شود. طبق گفته های وو و همکاران بالاترین تولید زیست توده، چربی و DHA برای Schizochytrium sp. S31 در نزدیکی pH خنثی (7.0) بدست آمد. در محدوده pH 5.0-7.0 ، گلوکز به طور کامل تحلیل رفته شد اما تولید چربی و DHA در محیط کشت با pH  کمتر از 7.0 ، با کاهش همراه بود. بالاتر از pH 7.0 ، رشد و تولید چربی رخ نداد. بنابراین، pH محیط کشت باید تا حد ممکن نزدیک به حد مطلوب مورد نیاز میکرو جلبک های خاص حفظ شود ، در غیر این صورت ارگانیسم مجبور است انرژی که برای رشد و تولید لیپیدها استفاده نخواهد شد را برای شروع ترمیم pHتلف کند.

4.5.دما

دما یک عامل کلیدی برای رشد جلبک و ترکیب بیوشیمیایی زیست توده محسوب می شود.

همچنین می تواند عاملی باشد که در فرایند جهانی مصرف انرژی تأثیر می گذارد. معمولاً دمای بالاتر تخمیر رشد سلول را افزایش می دهد ، در حالی که درجه حرارت پایین تر باعث افزایش اسیدهای چرب اشباع نشده می شود. صفدار و همکاران. رابطه منفی بین مقدار DHA و دمای کشت گزارش کرده اند. مقدار DHA بالاتری در محدوده دمای 15-20 درجه سانتی گراد،که تقریبا 40٪ بیشتر از مقدار موجود در 40درجه سانتی گراد بود، بدست آمد. محتوای چربی همچنین با افزایش دما ،کاهش یافته و در دمای 20 درجه سانتی گراد  به حداکثر خود رسید ، در حالی که حداکثر تولید زیست توده در 25-30 سانتی گراد به دست آمد. این به این دلیل است که در دمای پایین ، میزان نفوذپذیری غشای سلولی کاهش می یابد و به منظور جبران این امر و حفظ ساختار و خصوصیات غشای سلولی ، سلول ها با ارتقاء بیان بیش از حد ژن ها برای دساچیورازها (acyl-CoA   دساچیورازها   ، دساچیورازهای آسیل- ACP ، و دساچیورازها آسیل لیپید) پاسخ می دهند که منجر به اشباع زدایی لیپیدهای غشایی و افزایش تولید اسیدهای چرب اشباع نشده می شود که به حفظ سیالیت غشاء کمک می کند. ژو و همکارانش بیان کردند که Schizochytrium limacinum می تواند در دماهای 16 تا 37 درجه سانتی گراد رشد کند ، در حالی که مطلوبترین محصول تولید DHA در دمای  23 درجه سانتی گراد  بدست آمد. به نظر می رسد ،با صرف نظر از جنس میکرو جلبک ها ، دمای مطلوب برای رشد میکرو جلبک ها با دمای بهینه برای تولید DHA مطابقتی ندارد.

4.6. شوری

اغلب میکرو جلبک های هتروتروف که تولیدکنندگان ترکیبات امگا -3 هستند میکروارگانیسم های دریایی اند. بنابراین، برای رشد به یک محیط کشت شور نیاز دارند.

شوری با کنترل شیب یون سیتوپلاسمی و فعالیت آنزیم های درگیر در توسعه دیواره سلولی، رشد میکروارگانیسم های دریایی را تحت تأثیر قرار می دهد. معمولاً برای میکرو جلبک های دریایی ، سطح شوری برای تطابق آنهایی که در دریا وجود دارند، تنظیم می شود. سطح نمک موجود در زیست توده برای تخمیر بهینه بین میکرو جلبکهای مختلف متفاوت است. د سوواف و همکاران حداقل غلظت نمک دریایی gr/L17.8 را برای رشد بهینه   C. cohnii گزارش کرده اند. با این حال، شوری آب دریا برای ظرف های فولادی کشت  که در مقیاس بزرگ مورد استفاده قرار می گیرند مضر بوده  باعث پوساندن دیواره ها می شود. توسعه یک محیط کشت کم کلرید و استفاده از سویه های سازگار از طریق تکنیک های توسعه بهترین نمونه های سویه ممکن است بر این مشکل غلبه کند. با این وجود، یک حق ثبت اختراع از استفاده از محیط کم کلرید محافظت می کند، که استفاده از آن را محدود می کند. توانا رشد میکروارگانیسم ها در محیط کم نمکی ،یک نیاز مهم در میکروارگانیسم های روغنی صنعتی محسوب می شود. در حال حاضر ، 304 رتبه استاندارد فولاد ضد زنگ است که در ساخت بیورآکتورها استفاده می شود ، که می تواند 0.3-0.5 gr/l       نمک تحمل کند. ظروف بیورآکتور ساخته شده با فولاد استاندارد ضد زنگ  مرتبه 316 می توانند تا 1.6 gr/l نمک   مقاومت کنند اما بسیار گران تر است. با این وجود ، این غلظت نمک برای کشت ارگانیسم های آب دریا مانند C. cohnii خیلی کم است. فولاد ضد زنگ مقاوم در سفارشی یا روکش دار یک راه حل است، اما به هزینه های سرمایه گذاری بالایی نیاز دارد. با این وجود، اکثر بیواکتورهای مورد استفاده در Martek Biosciences Corporation از فولاد ضد زنگ با رتبه بالا (انواع 317L  2205 یا AL6XN) ساخته شده اند، همچنین سویه های استفاده شده غلظت کلرید پایین تری را می پسندند. Thustochytrids، با وجود اینکه موجود دریایی است، در محیط کم نمک  قابل رشد است. Schizochytrium نسبت به شوری تحمل بالایی دارد و می تواند در طیف گسترده ای از شوری 5-35 ppt رشد کند که یک مزیت مهم برای محصول تجاری است.

4.7.نظارت بر محیط کشت میکروجلبک توسط فلوسایتومتری

بسیاری از گزارش های اخیر تولید  لیپید / DHA از میکرو جلبک های هتروتروف از روش های مرسومی برای نظارت بر رشد ریز جلبک ها در طول کشت ، مانند تراکم نوری، وزن سلول های خشک و شمارش سلول استفاده می کنند. با این حال، این روشها هیچ اطلاعاتی در مورد حالات فیزیولوژیکی سلولی ارائه نمی دهند. این اطلاعات زمانی مهم است که سلول ها در شرایط نامساعد و سخت رشد کنند ، مانند محیط کشت هایی که حاوی پساب های صنعتی / ضایعات / پسماندها هستند زیرا همچنین آن ها  حاوی ترکیبات مهاری هستند. در موارد دیگر ، مرحله قبل از فرآوری مواد اولیه لازم برای رهاسازی قندهای مونومر توسط میکروارگانیسم ها نیز ممکن است ترکیبات مهاری را آزاد کند که ممکن است منجر به مرگ سلولی یا آسیب هایی شود که بر متابولیسم آن اثر می گذارد، که باعث کاهش عملکرد فرآیند می شود. نمونه ای از اثر مهاری بر میکروارگانیسم های ضایعات حاوی ترکیبات سمی توسط سارما و همکاران گزارش شده است.آن ها که اثر ناخالصی های گلیسرول، یعنی متانول، سدیم کلسیم و صابون ها را بر باکتری تولید کننده هیدروژن Enterobacter aerogenes مورد مطالعه قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که صابون ها و متانول اثر مهاری مهمی در تولید میکروبی هیدروژن دارند.FC همراه با رنگ های اختصاصی ،اطلاعات همزمانی در مورد چندین عملکرد سلولی و بخش های آن می دهد. ارائه اطلاعات در مورد پاسخ به تنش سلولی و درک مکانیسم های بقای سلولی که توسط این شرایط ایجاد می شوند ، امکان پذیر است. درک چنین مکانیسم هایی امکان توسعه سویه های میکروجلبک مقاومت تر در برابر این مهار کننده ها و استفاده از راهکارهای کنترل زیست سنجی کارآمدتر بر اساس اطلاعات سایتومتری چند پارامتری  را فراهم می کند. سلول های میکرو جلبک برای تجزیه فلوسیتومتری ایده آل هستند زیرا تک سلولی و بزرگتر از اکثر میکروب ها هستند و به راحتی از پس زمینه و پارازیت متمایز می شوند. لوپز دا سیلوا و همکاران. از FC همراه با یدید پروپیدیوم برای نظارت بر تمامیت غشای سلولی سلول های C. cohnii CCMP 316 در حضور افزایش غلظت n-dodecane، که به عنوان یک حامل اکسیژن و به منظور بهبود دهنده تولید DHA بود، استفاده کردند. با این وجود، این روش به ندرت در تولید لیپیدهای میکرو جلبک مورد استفاده قرار گرفته است.

تکنیک های مرسوم برای تعیین کمیت و توصیف لیپیدها در سلول های میکرو جلبک ،متکی به روش های وقت گیر، نیروی کار و تجهیزات مانند آزمایش طیف سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی (GC-MS) از تجزیه و تحلیل متیل  استرهای اسید چرب (FAME) است. اندازه گیری لیپیدهای سلولی معمولاً از طریق روش های تشخیص گرانشی لیپید انجام می شود. این روش ها بسیار وقت گیر است و معایب متعددی از جمله نیاز به مقادیر زیاد برای حلال های سمی آلی و مقادیر قابل توجه زیست توده برای اندازه گیری چربی را نشان می دهد. نکته مهم این است که روش های گرانشی معمولاً چند روز به طول می انجامند و غالباً نتایج فقط در صورت اتمام فرآیند در دسترس است و تغییر در شرایط کشت در طی فرآیند غیرممکن است. در مقابل، FC می تواند برخط تولید لیپیدهای میکروبی نظارت کند و نتایج آن چند دقیقه پس از جمع آوری نمونه در دسترس باشد. با این اطلاعات که نزدیک به زمان عملی بدست آمد،امکان تغییر شرایط تکاملی(مثل ضریب کربن و  نیتروژن ،تغذیه و هوادهی و …)در طی تکامل کشت به منظور بهبود تولید لیپید سلولی وجود دارد.  تولید چربی C. cohnii توسط FC با استفاده از فلوروکروم Nile Red اندازه گیری شده است. هنگام نظارت و بررسی فرایند تولید لیپیدهای میکروجلبک، بررسی حیات سلولها بسیار مهم است. چراکه قسمت زیادی از سلولهای مرده‌ی موجود در هر قسمت فرایند زیستی ، بخاطر کاهش بازده فرایند ،‌مضر خواهد بود.

  1. فرایندهای پایین‌تر

5.1. استخراج روغن :

در پایان تخمیر جلبک، زیست توده باید از محیط آبی جدا شود که معمولا به کمک سانتریفیوژ ،‌فیلترینگ چرخشی خلا و یا فیلترینگ مستقیم انجام می شود. در نهایت، این ماده‌ی رقیق و فوق‌العاده می تواند برای تولید بیوگازها به منظور جلوگیری از یک مرحله پردازشی عظیم ، مصرف شود. این اتفاق بر اساس قوانین زیست محیطی محلی ، برای تخلیه‌ی ایمن آنها در سیستم آبی اجرا می شود.

استخراج روغن از توده زیستی میکروجلبک شامل فشرده سازی مکانیکی، هموژنیزه شدن، فرزکاری و استخراج حلال است. مرحله‌ی خشک کردن معمولا به منظور ساخت یک زیست توده پایدار و آزاد از آب انجام می شود که می تواند برای زمان طولانی بدون تخریب ، ذخیره شود. برای این مرحله معمولا اسپری یا ظروف  خشک مورد استفاده قرار می گیرند. همچنین باید به TAG های حسگر گرمای درون سلولی هم توجه خاصی شود تا از ورود زیست توده به دماهای بالا جلوگیری شود. چراکه این ترکیبات در دماهای بالاتر ازC  ْ50 تخریب می شوند.

مرحله‌ی بعدی شامل شکستن سلول‌های جلبک برای آزادسازی روغن از سلول‌هاست. روش‌های مختلفی می تواند برای تخریب سلول‌های آلگال استفاده شود ؛ مثل :

  • فشار بالا
  • هموژنیزه کردن
  • کاویتاسیون هیدرودینامیک
  • روش های میدانی الکترونیکی آلتراسونیک / ماکرو وِیو / تپشی
  • استخراج حلال
  • مایعات یونی
  • سورفاکتانت
  • کف سازی مستقیم
  • آنزیم‌های هیدرولیتیک
  • روش های آلگالیکی (به دنبال استخراج حلال)

پرمصرف ترین روش، روش استخراج حلال با حلال های رایج کلروفرم-متانول / هگزان-ایزوپروپانول و یا دیگر مخلوط ها که کمی درهم مخلوط هستند. بسته به قطبیت یا حلالیت بخش لیپیدها، برای استخراج باید از حلال یا مخلوط کافی استفاده شود. با این حال ، باید توجه داشت که لیپیدهای میکروبی که در صنایع غذایی مورد استفاده قرار می گیرند ، نمی توانند بخاطر جلوگیری از باقی مانده های حلال در مواد غذایی، با حلال های سمی استخراج شوند.

مقرون به صرفه ترین روش هنوز استخراج با هگزان است، به ویژه هنگامی که لیپیدهای استخراج شده قرار است در برنامه های خوراکی / مواد غذایی / دارویی / تغذیه ای مورد استفاده قرار گیرند. در این حالت ، لازم است اطمینان حاصل شود که هیچ حلال رسوب‌شده‌ای در روغن باقی نمی ماند.

یک جایگزین دیگر ، استفاده از استخراج مایعات فوق سمی (معمولاً با CO2 فوق سمی) است که معمولاً باقیمانده حلال را در روغن استخراج نشده باقی نمی گذارد .البته این روش نسبت به روش های کلاسیک استخراج حلال ، گران تر است. با این حال، به دلیل حساسیت بالا به تخریب اسیدهای چرب اشباع نشده با زنجیره طولانی، فرآیند تولید میکرو جلبک باید با احتیاط انجام شود. حفاظت طبیعی از PUFA های طولانی در داخل بدن ، به دلیل آنتی اکسیدان هایی که در داخل سلول وجود دارند ، پس از پارگی سلول دیگر وجود ندارد.

اگر PUFA ها با رادیکال های اکسید شده واکنش نشان دهند، یک واکنش زنجیره ای پیچیده شروع می شود و منجر به روغن های سخت و بودار می شود که غیر خوراکی هستند. بنابراین، تمام موادی که می توانند واکنش اکسیداسیون را تحریک کنند (مثل مس ، فلز آهن) باید از مناطقی که استخراج و ذخیره روغن انجام می شود حذف شود. به همین دلیل، جلوگیری از لیز سلولی قبل از مرحله خشک کردن نیز مهم است. قبل از مرحله پالایش، روغن زغال سنگ خام باید معمولاً در محیط نیتروژن خنک نگه داشته شود. زیست توده ضعیفِ بدون روغن ممکن است کاربردهای مختلفی داشته باشد.

5.2. تصفیه ترکیبات ω-3 :

در حال حاضر ، روش هایی مانند زمستانه شدن (مرحله‌ای از فرایند تصفیه روغن که در آن مولکولهای روغن با نقطه ذوب بالا از آن جدا می شوند که این عمل با سرد شدن روغن انجام میگیرد)، ترکیب اوره، تقطیر مولکولی و استخراج مایعات فوق سمی CO2 برای استخراج و تصفیه PUFA های ω-3 PUFA از میکرو جلبک ها، در مقیاس ویژه استفاده می شود. سرماسازی یا همان زمستانه شدن یکی از ساده ترین روش ها برای غلظت اسیدهای چرب ω-3 است.

این فرایند از اختلافات موجود در نقاط ذوب اسیدهای چرب مختلف به عنوان روغن‌های صاف و یا در سیستم های حلال مختلف استفاده می کند. نقاط ذوب اسیدهای چرب به میزان اشباع آنها بستگی دارد. اسیدهای چرب اشباع شده اکثرا دارای نقاط ذوب بالاتری هستند و از مخلوط‌ها تبلور می یابند و اسیدهای چرب اشباع نشده تر را در خود جای می دهند.

یکی دیگر از روشهای کارآمد ، ساده تر و ارزانتر برای غلظت و تصفیه اسیدهای چرب امگا 3 از منابع طبیعی ، روش ترکیبی اوره است. تشکیل تجمع بین اوره و اسیدهای چرب اشباع شده با زنجیره مستقیم باعث جدایی کارآمد برای شکافی از اسیدهای چرب آزاد یا استرها می شود. در ابتدا ، TAG های روغن با استفاده از هیدرولیز قلیایی با KOH یا NaOH الکلی به اسیدهای چرب تشکیل دهنده آنها هیدرولیز می شوند. اسیدهای چرب آزاد حاصل (FFAs) سپس با یک محلول اتانولی اوره برای تشکیل پیچیده مخلوط می شوند. مولکول های اوره به آسانی ساختار هایی با اسیدهای چرب اشباع و اشباع نشده ایجاد می کنند و به عنوان یک فاز جامد در خنک کننده که توسط تصفیه حذف می شود ، متبلور می شوند. اسیدهای چرب امگا 3 در شکاف مایع باقیمانده اند.

در مرحله تبلور می توان از دمای محیط تا 20 درجه سانتیگراد استفاده کرد. این فرایند سازگار با محیط زیست است. چراکه شامل مواد شیمیایی سازگار با محیط زیست (FFA ها، اوره ، اتانول، آب) است که توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده به عنوان ایمن در نظر گرفته شده است (معروف به GRAS). تبلور شکافی با درجه حرارت پایین، روش های کاتالیز شده با آنزیم و تقطیر مولکولی هر سه می توانند به صورت متوالی قبل یا بعد از روش افزودنی اوره مورد استفاده قرار گیرد، و در نتیجه شکاف امگا 3 بسیار پالاینده است.

به تازگی یک پروتکل ساده و ارزان برای غلظت DHA و تصفیه آن از زیست توده C. cohnii توسعه یافته است ، که شامل مراحل پی در پی و متیلاسیون متوالی در زیست توده مرطوب است، و پس از آن زمستان سازی و مجتمع اوره می باشد. بیشترین غلظت شکاف DHA ( 99.2% از کل اسیدهای چرب ، TFA) برای نسبت اوره/اسیدهای چرب از 3.5 و دمای تبلور 4 و 8 درجه سانتیگراد بدست آمده است. بالاترین پیشرفت DHA ( 49.9%) نیز برای نسبت اوره/اسید چرب0.4 و دمای تبلور 24 درجه سانتیگراد، که مطابق با 89.4% از DHA TFA ها بود،  مشاهده شد.

یک ترکیب امگا 3 ، این شکاف را از یک دیانوفلاژلای دریایی تغلیظ می کند. این تغلیظ با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس بدست می آید که در آن ، شیب پاکسازی با استفاده از استونیتریل کلروفرم و تشخیص پراکندگی نور تبخیری صورت می گیرد. شرایط بهینه استخراج 30.0 MPa و 323= K در این شرایط یافت شد . ترکیب DHA به میزان 72٪ فرمول w/w ( وزنی وزنی )  کل اسیدهای چرب (TFAs) بدست آمد. با این حال ، علی رغم مزایای این روش ، استخراج مایعات فوق بحرانی و روش پیچیده اوره هنوز در تصفیه ترکیبات امگا 3 در مقیاس تجاری اعمال نشده است.

شرکت Bioscience Market یک فرآیند بازیابی و تصفیه در مقیاس بزرگ DHA از روغن جلبک تولید شده از Schizochytrium sp و C. cohniiرا توصیف کرده است. از آنزیم پروتئاز برای شکستن Spizochytrium SP به منظور رها کردن روغن در مایع ، دیواره سلولی استفاده می شود. از آنجا که C. cohnii ساختار دیواره سلولی بسیار پیچیده تری دارد و حاوی یک لایه سلول سلولزی است ، استفاده از آنزیم پروتئاز برای شکستن دیواره آن امکان پذیر نیست. معمولا از هگزان برای استخراج روغن میکروجلبک C. cohnii از زیست توده خشک پس از همگن سازی فشار زیاد استفاده می شود. پس از آن ، بقایای سلول خارج شده و روغن توسط تبخیر، بازیابی می شود.

پس از استخراج، بخش PUFA به دلیل وجود ناخالصی ها، بو، طعم و شکل ابری، هنوز برای مصرف انسان مناسب نیست. یک مرحله پالایش برای از بین بردن فسفولیپیدها، مواد غیرقابل تصفیه، مواد ذرات و آلودگی های شیمیایی مانند موارد زیر می توانند باعث بهبود رنگ و و ضوح و عطر روغن شوند :

  • اسیدهای چرب آزاد
  • فسفاتیدها (لسیتین)
  • رنگدانه ها (کاروتنوئیدها ، کلروفیل)
  • اثر مواد مذاب
  • استرول ها (کلسترول)
  • تک گلیسیریدهای مونوآکیل و دیآکیل
  • مومها
  • محصولات اکسیداسیون
  • آلاینده های کمیاب

 

 

  1. تولید صنعتی و برنامه های کاربردی EPA / DHA

بازار جهانی EPA / DHA از سال 2013 به سرعت در حال رشد است. در این زمان، این بازار 124 هزار تن و تقریباً 2 میلیارد یورو تخمین زده شده است. پیش بینی می شود تا سال 2020 241 هزار تن با ارزش 4.2 میلیارد یورو باشد. افزایش نفوذ ترکیبات امگا 3 در بازار فعال دارویی Ingredient (API) نیروی محرکه صنعت بوده است که با افزایش آگاهی در مورد فواید ترکیبات امگا 3 بر سلامت انسان. علاوه بر این ، آیین نامه های اخیر به عنوان یکی از نیروهای محرک برای گسترش دامنه برنامه ها، از استفاده از محصول در فرمول بندی های نوزادان حمایت می کند.

روغن جلبک از Crypthecodinium cohnii، Schizochytrium sp. و Ulkenia sp. برای غنی سازی غذا و خوراک یا به عنوان مکمل های غذایی با نام های تجاری مختلف در سراسر جهان استفاده می شود. روغن میکرو جلبک همچنین می تواند مستقیماً به عنوان ترکیبات خوراک دام برای تولید تخم مرغ ، مرغ و گوشت خوک غنی شده در DHA استفاده شود. در آبزی پروری از میکرو جلبک ها به عنوان یک محصول تازه یا به عنوان گلوله های خشک استفاده می شود که باعث حفظ محتوای غذایی میکرو جلبک ها می شود. در این حالت ، زیست توده میکروجلبکی ابتدا پس از قرار گرفتن در معرض جریان هوا، لخته شدن یا رسوب، فیلتر می شود و سپس خشک شده تا گلوله ها تشکیل شود یا مستقیماً روی دامها تجویز گردد.

اگرچه کاربردهای اصلی روغنهای میکروجلبک ابتدا در تغذیه نوزادان بوده است ، اما در حال حاضر رشد سریع روغنها برای مصرف بزرگسالان در حال انجام است. فرمول های مصرفی در تغذیه نوزادان مهمترین کاربرد نهایی روغن DHA (حدود 49٪ از حجم در سال 2012) ، و پس از آن مکمل های غذایی (28٪) ، مواد غذایی و نوشیدنی (19٪) و خوراک دام (حدود 4٪) هستند.

  1. تولیدکنندگان صنعتی EPA/DHA

TheDSMenterprise تولید کننده عمده DHA در سراسر جهان از جلبک ها است. این ماده روغن های جلبک را از میکروارگانیسم های هتروتروفیک Schizochytrium sp ، مانند محصولات  Life’s DHA™ و  Life’s OMEGA™ تولید می کند. روغن جلبک حاوی 50٪ روغن EPA / DHA DHASCO ، برای نوزادان ، توسط محصولات مغذی DSM  تولید می شود ، که از میکرو جلبک Crypthecodinium cohnii استفاده می کند ، و حاوی محتوای DHA 40-45٪ w / w و بدون EPA است. روغن Life’s DHA ( یک روغن جلبک برای صنایع غذایی ، آشامیدنی و مکمل ) نیز توسط DSM تولید می شود و از میکروارگانیسم اسکیزویتریوم حاوی 35٪ یا 40٪ DHA و سطح پایین EPA (کمتر از 2%) حاصل می شود. Life’s OMEGA3، یک محصول تجاری شبیه به روغن ماهی از نظر ترکیب امگا 3 است، که حاوی حداقل 40٪ از کل DHA و EPA (حداقل 24٪ DHA و 12٪ EPA) و از سویه Schizochytrium توسط DSM تولید می شود.

Lonza ، مانند DSM ، یک ماده سازنده مواد مغذی است و ماده ای از روغن و پودر ، DHAid را برای صنایع غذایی به فروش می رساند که از میکرو جلبکهای هتروتروفیک تولید می شود. DHAid محصولی است که از TAG ها تشکیل شده است (> 95٪) که حاوی کل محتوای DHA 38-50٪ است، که از Ulkenia SP حاصل می شود.

همانطور که در بالا ذکر شد ، کل زیست توده میکروجلبک در بازار به فروش می رسد. روغنهای تجدید پذیر Solazyme Bunge (روغنهای SB ) می توانند algaprime DHA ، یک محصول کامل جلبک را برای بازار خوراک آبزی پروری تولید کنند. این مرکز در برزیل مستقر است و از نیشکر برای رشد روغن غنی از DHA تولید میکروجلبک شیزوسیتریوم استفاده می کند. پسماند نیشکر منبع تجدید پذیر انرژی برای تأسیسات است.

  1. پلتفرم کارخانه‌ی زیستی هتروتروفیک

امکان به دست آوردن چندین محصول از میکرو جلبک ها (به عنوان مثال روغن ها ، رنگدانه ها ، پروتئین ها و کربوهیدرات ها) منجر به تحقیق و توسعه بیورفینتری های بیولوژیکی مبتنی بر میکرو جلبک ها شده است ، تا بتوانید وسیع ترین محصولات زیستی حاصل از زیست توده میکروجلبکی را به دست آورید و از مزایای آن استفاده کنید.

محصولات مختلفی توسط میکرو جلبک ها سنتز می شوند و حداکثر مقدار حاصل از کل فرآیند را با حداکثر تأثیر محیطی مطلوب به دست می آورند. در مفهوم زیست گیاهی، هنوز هم به ندرت در زیست توده میکروجلبک هتروتروفیک مورد استفاده قرار می گیرد ، اسیدهای چرب امگا 3 را می توان از چربی های میکروجلبک باقی مانده جدا کرد ، که می تواند برای بیولوژی یا تولید بیودیزل مورد استفاده قرار گیرد.

در ادامه ، چانگ و همکارانش یک نژاد استرالیایی Aurantiochytrium sp ، TC 20 ، را برای تولید بیودیزل و امگا 3 PUFA های با ارزش بالا ، جدا کرد. مشخصات اسیدهای چرب ساده این سویه ، با داشتن هر دو اسیدهای چرب اشباع شده (45-52 w وزنی WWW به عنوان 16: 0) و امگا 3 (39-48٪ وزنی / وزنی TFA به عنوان DHA)است . این مواد به عنوان ترکیبات اصلی ، توان تبدیل بالقوه را دارند و کاندید بسیار خوبی برای تولید PUFA های امگا 3 و بیودیزل هستند. نویسندگان، هیچ بخشی از این بخش های لیپیدی را از یکدیگر جدا نکردند ، اما یک مرحله مضاعف زمستانه شدن را برای جداسازی بخش امگا 3 PUFAs از شکاف اسیدهای چرب باقیمانده که می توان برای اهداف بیودیزل استفاده کرد، پیشنهاد کردند. این روش برای غنی سازی فرآورده های کنسرو ماهی از تولید ترکیبات امگا 3 و بیودیزل استفاده شده است.

صنایع مختلف قادر به استفاده از محصولات مختلف جلبک هستند :

  • کل زیست توده میکروبی توسط صنایع غذایی، خوراک و کشاورزی قابل استفاده است.
  • صنایع داروسازی و مواد مغذی از محصولات لیپیدی با ارزش افزوده و ارزش بالا مانند میکروجلبک PUFA و کاروتنوئیدها استفاده می کنند.
  • صنعت حمل و نقل می تواند از اسیدهای چرب حاصل از TAG های میکروجلبک برای بیودیزل استفاده کند.
  • صنایع شیمیایی می توانند از محصولاتی مانند گلیسرول به دست آمده از صنعت بیودیزل استفاده کنند و بقایای زیست توده روغن‌گیری شده ، سرشار از کربوهیدرات ها ، پروتئین ها و مواد معدنی ، می تواند به عنوان خوراک، کود و بستر برای تولید بیو متان مورد استفاده قرار گیرد.
  • تبدیل حرارتی و شیمیایی این زیست توده صرف شده ممکن است باعث ایجاد سوخت و سایر مواد شیمیایی شود.

 کمترین کاربرد با ارزش زیست توده میکروجلبک‌زدایی شده برای جذب رنگ‌ها و فلزات سنگین از پسماندهای صنعتی مورد استفاده قرار می گیرد. تمام این محصولات ریزگردها، که در یک فرآورده های زیستی بر اساس اصول زیست فناوری چرخه به دست می آیند و هدف آنها تولید کمترین مانده است، می توانند با پیشرفت اقتصادی این فرآیند، ارزش بیشتری به فرایند تولید بیفزایند و ممکن است چهار حوزه مهم از اهمیت در جامعه بشری را شامل شود: بهداشت انسان، انرژی، غذا و امنیت محیط زیست.

  1. تست پایداری معیار کارخانه زیستی امگا 3

اکثر توصیه های بهداشتی حاکی از مصرف روزانه 250-1000 میلی گرم اسیدهای چرب امگا 3 (EPA و DHA) در بزرگسالان است، یعنی برای 7 میلیارد نفر، مصرف سالانه حدود 1.3 میلیون تن از آن الزامسیت. از این اسیدهای چرب امگا 3 برای تغذیه و کاربردهای دارویی معمولاً در روغن ماهی تهیه می شوند.

 همانطور که گفته شد، صنعت ماهی حتی با بکارگیری ماهی های وحشی و آبزی پروری، برای برآوردن تقاضای روغن ماهی کافی نخواهد بود و افزایش بیشتر باعث از بین رفتن جمعیت ماهی می شود. میدانیم که ترکیبات امگا 3 به دست آمده از روغنهای میکرو جلبک در حال حاضر گرانتر از روغنهای ماهی است. همچنین یک استراتژی احتمالی برای افزایش رقابت برسر این ترکیبات به دست آمده از میکرو جلبک ها شامل ارزش گذاری تمام کسری زیست توده میکرو جلبک ها ، وجود دارد.

البته هیچ گزارشی درباره رویکردی که در مقیاس تجاری ریز جلبک های هتروتروفیک اعمال شود، وجود ندارد. حتی در مقیاس آزمایشگاهی، هیچ آثاری با توجه به زیست توده های زیست توده میکروجلبکی هتروتروف و ارزیابی پایداری آن وجود ندارد. به عنوان مثال ، یک تحقیق جدید به استفاده از فاضلاب آبزی پروری به عنوان یک بستر مغذی برای کشت میکرو جلبک ها و تولید لیپیدها و پروتئین ها اشاره می کند، اما فرآیند مقیاس بندی شده و پایداری کارخانه زیستی موردنظر را ارزیابی نکرده است.

شرح مختصری در مورد تولید ترکیبات امگا 3 در دو گیاه زیستی در ادامه ارائه خواهد شد. برای این منظور، ما فرآیندهای شبیه سازی های موجود را در کارخانه های زیستی واقعی موجود در بازار را در نظر گرفتیم. شاخص های پایداری در نظر گرفته شده هزینه  موارد زیر بود :

  • هزینه ابزار
  • هزینه تجهیزات
  • هزینه سرمایه-CAPEX
  • هزینه عملیاتی OPEX
  • نیازهای انرژی مستقیم
  • حرارتی و برقی
  • انتشار CO2eq مشتق شده

سیستم مرجع، مربوط به تبدیل زباله های ماهی به EPA / DHA است که در یک مفهوم زیستی از یک کارخانه فرآوری قزل آلا واقع در استان Trentino در ایتالیا کشف شده است. این کارخانه زیستی شامل مراحل زیر است :

  • استخراج روغن از ضایعات ماهی
  • انتقال روغن ماهی با اتانول
  • غلظت امگا 3 بر اساس کسری CO2 فوق بحرانی.

 پروتئین ها به عنوان غذای ماهی ، دارای ارزش هستند  در حالی که گلیسرول یک محصول تجاری محسوب می شود و اسیدهای چرب اشباع و اسیدهای چرب اشباع نشده با زنجیره کوتاه به عنوان سوخت زیستی مایع در نظر گرفته می شوند.

جدول2. 9. تست پایداری معیار کارخانه زیستی امگا 3 (DHA و EPA )

شکل 3. تفاوت در روشهای ارزیابی چرخه زندگی محیطی eLCA (a) و روش ارزیابی ارزیابی پایدار چرخه زندگی (ILCSA) (b)

جدول 2 یافته های ما را از منابع بررسی شده خلاصه می کند. مثالهای اینجا مرزهای مختلفی در رابطه با هزینه ها و انتشار CO2eq دارند، بنابراین مقایسه بین این دو کاملاً متفاوت است. با این وجود ، از این اسناد می توان نتیجه گرفت که میکروجلبک های اتوماتیک نیاز به پیشرفت انرژی و در نتیجه ، هزینه بیشتری دارند (به نظر می رسد تولید میکرو جلبک گرانترین مرحله است یعنی بیش از 50٪ از کل هزینه ها). هر دو مثال نشان داده شده در جدول 2 از عصاره فوق سمی CO2 برای استخراج روغن میکروجلبک استفاده کرده است ، که اگرچه روشی مناسب برای استخراج PUFAs است (همانطور که در بخش 5 به آن اشاره شده است) ، می تواند یک مصرف کننده اصلی انرژی و در نتیجه،  شرکت کننده اصلی CO2eq باشد. در مثالهایی که در جدول 2 نشان داده شده است ، این روش استخراج نیاز به 50 ~ درصد از نیازهای حرارتی و 60 ~ درصد از نیازهای برقی دارد.

شکل 4. مرجع تولید PUFA صنعتی به عنوان ورژن بعدی گزارش شده آن در اروپا

پروژه PUFA CHAIN: جلبکهای هتروتروفیک با زباله های صنعت ماهی با هم پردازش می شوند

  1. تنگناها ، چالش ها و دیدگاه های آینده

توسعه فرآیندهای میکرو جلبکهای هتروتروفیک به سمت ترکیبات امگا3 ممکن است یک روش بیوتکنولوژی جایگزین برای تولید محصولات مفید فراهم کند که در غیر این صورت به طور کامل و ناپایدار از دیگر منابع زنده مانند ماهی های چرب دریایی تولید شود، که همانطور که در بالا ذکر شد اشکالات زیادی را نشان می دهد. با این حال ، چنین رویکردی هنوز چالش ها و موانع بسیاری را ارائه می دهد که باید برای تقویت تولید میکرو جلبک های هتروتروفیک ترکیبات امگا حل شود. از آنجا که باکتری ها معمولاً سریعتر از میکرو جلبک ها رشد می کنند ، آلودگی های باکتریایی در شرایط میکروجلبک هتروتروفیک بسیار متداول است، و در یک دوره زمانی کوتاه تبدیل به جمعیت اصلی (غالب) می شود. این امر زیست توده میکروجلبکی را آلوده می کند، که برای کاربردهای تجاری ناکافی است.

بنابراین، یک مرحله  گندزدایی قبلی از شرایط و تجهیزات متوسط ​​قبل از تلفیق مورد نیاز است، که این مرحله خواستار انرژی بالا است و نیاز به تجهیزات گران قیمت مانند اتوکلاوها، اتاقک های جریان چند لایه و دیگ های بخار دارد که این امر باعث افزایش هزینه های فرایند جهانی بخصوص در مقیاس بزرگ می شود.  این امر به ویژه در صورت استفاده از ضایعات صنعتی ( پساب ) مواد باقیمانده در کشت متوسط ​​که اغلب حاوی بار میکروبی زیاد است، بسیار مهم است. بنابراین، برای کاهش این هزینه باید روش های گندزدایی کم هزینه مانند استفاده از هیپوکلریت سدیم که ممکن است جایگزین روشهای گران قیمت گندزدایی در مقیاس بزرگ شود ، مورد بررسی قرار گیرد.

موضوع مهم دیگر در مورد شرایط میکرو جلبکهای هتروتروفیک مربوط به نیاز به یک اختلاط و هوادهی موثر در رطوبت است تا از محدودیت های انتقال جرم که باعث کاهش عملکرد فرآیند می شوند جلوگیری شود. مخلوط کردن زمان و نرخ هوادهی از بیورآکتورهای آزمایشگاهی به مراکز تولید در مقیاس بزرگ، بطور چشمگیری افزایش می یابد و بر عملکرد کلی بیوراکتور تأثیر می گذارد. اگر اختلاط ناکارآمدی در مسیر وجود داشته باشد، ناهمگنی های مکانی در غلظت مواد مغذی از مناطق راکد منشأ می گیرد که منجر به استرس سلولی می شود و این بر بازده کلی فرآیند تأثیر منفی خواهد گذاشت.

این امر به ویژه هنگام استفاده از میکرو جلبک های هوازی در مقیاس بزرگ بسیار حیاتی است، زیرا میزان اکسیژن آنها زیاد است و اغلب سلولهای میکروبی در شرایط اکسیژن محدود در معرض محیط قرار می گیرند، اما همیشه این نکته را در نظر داشته باشید که این میکروارگانیسم ها به ویژه در برابر استرس آسیب پذیر هستند. به همین دلیل، مهندسی ژنتیکی میکروجلبکهای هتروتروفیک می تواند نقش مهمی داشته باشد، روشی برای توسعه گونه های قوی تر به شرایط استرس زا است. این پیشرفت باید به سمت توسعه بیولوژیکی سویه های قوی تر انجام شود، و توسعه فن آوری بیورآکتورها قادر به تأمین اکسیژن کافی در زیر هم بزنید ملایم بدون حضور مناطق مرده هستند.

روشهای استخراج و خالص سازی برای PUFA های میکروجلبک عمدتاً در سطح آزمایشگاه مورد مطالعه قرار گرفته است. با این حال ، ترمیم متابولیت های داخل سلولی در مقیاس بزرگ هنوز هم ضروری است، زیرا همه روش های اختلال در سلول، استخراج یا تصفیه مقیاس پذیر نیستند. علاوه بر این، این روش ها تقاضای انرژی بالایی دارند. با این وجود، برخی فن آوری ها مانند همگن سازی فشار قوی، زمستانه شدن و ترکیبات مجاری اوره در مقیاس وسیع قابل دوام هستند، که نیاز به اثبات دارند. استفاده از کارخانه های زیستی میکرو جلبک های هتروتروفیک که در آنها میکروجلبک های هتروتروفیک، رقیق کننده ها را تولید کرده و طیف وسیعی از محصولات زیستی مانند PUFA ها و سوخت های زیستی را تولید می کنند، مبتنی بر اقتصاد چرخه است. در این کارخانه ها، اصول  و دستیابی به یک فرایند پایدار زیست محیطی و اقتصادی ضروری است.

در واقع، استفاده کامل از یک بیولوژی اقتصادی چرخه واقعی در این منطقه در آینده نزدیک، با بهره گیری از همه بخش های زیست توده میکروگروه هتروتروفیک، کشف و یکپارچه سازی فن آوری های الکترونیکی جدید برای استخراج، غلظت، شکاف، تبدیل و تصفیه چربی ها از میکرو جلبک ها، و تأکید بر لزوم بازیافت جریان های جانبی و ضایعات تولید شده در کل فرآیند، باعث برتری اقتصاد چرخه می شود. از طرف دیگر، امکان پردازش میکروجلبک های هتروتروفیک و ضایعات ماهی برای تولید ترکیبات امگا 3 می تواند اقتصاد چرخه را رونق بخشد و همچنین باید در مطالعات تحقیقاتی آینده مورد توجه قرار گیرد.

و در نهایت، آخرین و مهمترین نکته این است که نیاز فوری به تست پایداری زیست پالایش بیولوژیکی میکرو جلبک های هتروتروفیک وجود دارد. از نظر شاخص های پایداری ، این روش تجزیه و تحلیل پایداری چرخه زندگی (ترکیبی از چرخه زندگی اقتصادی، زیست محیطی و اجتماعی) با توجه به میکرو جلبکهای هتروتروفیک به تنهایی، یا با ضایعات ماهی ترکیب می شود زیرا مواد اولیه ترکیبات امگا 3 را به دست می آورند. کمتر از 26 تن (جدول 2) در رابطه با مصرف انرژی می تواند هدف اصلی عملکرد محیط زیست و 400 یورو (tonne PUFA)-1 برای هزینه های اقتصادی باشد.

اگر علاقه مند به رشته زیست شناسی هستید، می توانید از دیگر مقالات سایت دیدن فرمایید.

مترجمان: سرکار خانم زینب خشنود،سر کار خانم فاطمه علیزاده

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح دستگاه الایزا ریدر و کاربردهای آن پرداخته است.

دستگاه الایزا چیست؟

الایزا ریدرها که به آنها پلیت ریدر و یا میکروپلیت ریدر نیز گفته می شود، ابزارهایی هستند که در تشخیص رویدادهای زیست شناسی، شیمیایی یا فیزیکی نمونه ها در صفحه های میکروتیتر مورد استفاده قرار می‌گیرند. این دستگاه کاربرد گسترده ای در کشف دار، اعتبارسنجی‌های زیست‌شناسی، کنترل کیفیت و فرآیندهای تولید در صنایع دارویی و زیست‌فناوری دارد. فرمت‌های رایج تر میکروپلیت که در تحقیقات آکادمیک و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می‌گیرد دارای ۹۶ چاهک (ماتریس ۸ در ۱۲) است. میکروپلیت های سنگین تر (که ۳۸۴ یا ۱۵۳۶ چاهک دارند)، عموما برای غربالگری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد و توان را افزایش و هزینه را کاهش می‌دهد.

حالت های تشخیصی رایج دستگاه میکروپلیت ریدر شامل جذب، مشاهده فلورسانس، لومینسانس، قطبش فلوئورسانس و Time-resolved fluorescence است.

جذب

تشخیص جذب در میکروپلیت ریدرها بیش از سه دهه است که قابل دسترس است و برای اعتبارسنجی هایی نظیر الایزا، اندازه گیری پروتئین و نوکلئیک اسید یا فعالیت آنزیم استفاده می‌شود. یک منبع نور نمونه را با استفاده از طول موج خاص (انتخاب شده توسط یک قطعه نوری یا مونوکروماتور) روشن می کند و یک ردیاب نور که در طرف دیگر چاه قرار دارد، مقدار نور عبوری از طریق نمونه را اندازه گیری می کند. مقدار نور عبور داده شده،عموما به غلطت مولکول مورد نظر مربوط است. ارزیابی آمونیوم،نیترات،نیتریت،اوره،آهن و اورتوفسفات، نمونه‌هایی از آنالیزهایی هستند که به روش میکروپلیت ریدر تبدیل شده اند. بیشتر رنگ‌ سنجی های شیمیایی اخیر،به طور مستقیم برای استفاده در میکروپلیت ریدر توسعه یافته اند.

فلورسانس

تشخیص فلوئورسانس در فرمت میکروپلیت به طور گستره در دو دهه‌ی اخیر گسترش یافته است. طیف کاربردهای آن بسیار گسترده تر از استفاده از جذب است اما این ابزار غالبا گران‌تر است. در این نوع ابزار، اولین سیستم نوری،نمونه را با استفاده از طول موج خاصی روشن می‌کند.در نتیجه‌ی این روشنایی، نمونه نور ساطع می‌کند و سیستم نوری ثانویه،این نور ساطع شده را جمع‌آوری می‌کند و آن را (با استفاده از یک فیلتر یا سیستم مونوکروماتور) از نور خارجی مجزا می‌کند و این سیگنال را با استفاده از یک ردیاب نوری همانند لوله‌ی فوتومولتیپلر اندازه گیری می‌کند. از مزایای این روش نسبت به مشاهده‌ی جذب، حساسیت است؛ و دامنه‌ی کاربرد که انتخاب گسترده ای از برچسب های فلورسنتی که امروزه موجود هستند،به دست می‌دهد. به عنوان مثال،تکنیکی که تصویربرداری کلسیمی نامیده می‌شود، شدت رنگهای حساس به کلسیم را برای ارزیابی میزان کلسیم داخل سلولی اندازه گیری می کند.

لومینسانس

لومینسانس نتیجه‌ی یک واکنش شیمیایی یا زیست‌شناسی است.ردیابی لومینسانس از لحاظ نوری ساده تر از فلورسانس است؛به این دلیل که لومینسانس نیازی به یک منبع نور برای تحریک ندارد.

یک سیستم نوری لومینسانس تشکیل شده از یک محفظه‌ی خوانش نور و یک ردیاب PMT. برخی از پلیت ریدر ها یک ردیاب PMT آنالوگ را بکار می‌برند در حالیکه بقیه دستگاه‌ها،یک ردیاب شمارنده‌ی فوتون دارند. شمارنده‌ی فوتون به طور گسترده ای به عنوان حساس ترین وسیله تشخیص لومینسانس پذیرفته شده است. برخی پلیت ریدر ها چرخ های فیلتر یا سیستم های نوری سنجش طول‌ موج مونوکروماتور قابل تنظیم را برای انتخاب طول‌ موج‌های لومینسانس خاص را پیشنهاد می‌دهند.

قطبش فلورسانس

این تکنیک نیز بسیار شبیه به ردیابی FI است. تنها تفاوت دراین است که این سیستم شامل فیلترهای پولاریزاسیون است که در مسیر نور قرارگرفته‌اند. نمونه های داخل میکروپلیت با استفاده از نور پولاریزه (قطبیده شده) تحریک می‌شوند. بسته به تحرک مولکول‌های فلورسنتی که در چاه ها هستند، نور ساطع شده می‌تواند پولاریزه یا غیرپولاریزه باشد.برای مثال،مولکول‌های بزرگ موجود در محلول(مثل پروتئین) که به خاطر اندازه‌شان نسبتا آرام می‌چرخند، وقتی با نور پولاریزه تحریک می‌شوند، نور پولاریزه را ساطع می‌کنند. از سوی دیگر، چرخش سریع مولکول‌های کوچک‌تر، سبب دپولاریزه شدن سیگنال می‌شود. سیستم تحریک در این پلیت ریدر، فیلترهای پولاریزه را برای بررسی پولاریزه بودن (قطبیدگی) نور ساطع شده بکار می‌برد.سطح پایین پولاریزاسیون، نشان می‌دهد که مولکول ‌های کوچک آزادانه در محلول حرکت می‌کنند. سطح بالای قطبیدگی نور ساطع شده نشان‌ دهنده‌ این است که فلورسنت به یک کمپلکس مولکولی بزرگتر متصل شده است. در نتیجه، یکی از اساسی ترین کاربردهای ردیابی FI، ارزیابی اتصال مولکولی است؛ زیرا می‌توان تشخیص داد که آیا یک مولکول کوچک فلورسنت به یک مولکول بزرگتر غیر فلورسنت متصل شده یا نه؛ بدین صورت که اتصال سبب کاهش سرعت چرخش مولکول فلورسنت، و در نتیجه افزایش پولاریزاسیون می‌شود.

 

Time-resolved fluorescence

Time-resolved fluorescence  یا TRF بسیار شبیه به اندازه گیری شدت فلورسانس (FI) است.  تنها تفاوت آنها در زمان بندی فرایند تحریک / اندازه گیری است.  هنگام اندازه‌گیری FI، فرایندهای برانگیختگی و انتشار همزمان هستند و نور ساطع شده توسط نمونه در حین تحریک اندازه گیری می شود.هرچند سیستم های انتشار در از بین بردن نور تحریک قبل از رسیدن به ردیاب بسیار کارآمد هستند،میزان نور تحریک در مقایسه با نور انتشار به گونه ای است که اندازه گیری FI همیشه سیگنال های پس زمینه نسبتاً بالایی را نشان می دهد. TRF راه حلی برای این مشکل ارائه می‌دهد که مبتنی بر استفاده از فلورسنت های خاص تحت عنوان لانتانیدها است که این خاصیت را دارند که پس از گذشت مدت طولانی از تحریک (در حدود میلی ثانیه)، از خود نور ساطع می‌کنند؛ در صورتی که بیشتر رنگ‌های فلورسنت استاندارد فقط تا چند نانوثانیه پس از برانگیخته شدن، نور منتشر می‌کنند. در نتیجه می‌توان لانتانیدها را با استفاده از یک منبع نور پالس تحریک کرد و بعد نتیجه را اندازه‌گیری کرد. در این صورت پالس‌های زمینه‌ای در مقایسه با سنجش استاندارد FI کمتر خواهد بود. اشکالاتی که وجود دارد این است که ابزارها و معرف‌ها معمولا گران هستند و این که کاربردها باید سازگار با استفاده از رنگ‌های لانتانید خیلی خاص باشند.کاربرد اصلی TRF در غربالگری دارو،تحت عنوان TR-FRET (time-resolved fluorescence energy transfer) یافت می شود. سنجش TR-FRET بسیار مقاوم است و می‌توان به راحتی آن را در مقادیر کوچک بکار برد.استحکام،قابلیت خودکارسازی و کوچک سازی ویژگی‌های مورد توجه در آزمایشگاه غربالگریست.

پراکندگی نور و نفلومتری

پراکندگی نور و نفلومتری، روش‌هایی برای تعیین قسمت حل‌ نشده‌ یک محلول هستند. یک باریکه‌ نور از نمونه عبور داده می‌شود و این نور توسط ذرات معلق پراکنده می‌شود. نور پراکنده‌ای که در قسمت دیگر محلول اندازه‌گیری می‌شود، نشان‌ دهنده‌ مقدار ذرات حل‌ نشده‌ موجود در محلول است. کاربردهای رایج پراکندگی نور/نفلومتری، شامل غربالگری خودکار حلالیت دارو،سینتیک رشد میکروبی طولانی مدت،لخته سازی و… است.

ابزارها و ارزیابی‌ها

بسیاری از روش های تشخیصی (جذب،فلورسنت،لومینسنس و….) بصورت مستقل در میکروپلیت های اختصاصی در دسترس هستند، اما اغلب بصورت ترکیب شده در یک دستگاه یافت می‌شوند. همچنین ابزارهایی برای اندازه‌گیری نور دینامیک و استاتیک پراکنده شده از نمونه‌ها در میکروپلیت موجودند. محدوده‌ی کاربرد میکروپلیت ریدرهای چند حالته بسیار وسیع است.

 کاربردهای این دستگاه‌ الایزا

الایزا

ارزیابی پروتئین و رشد سلولی

اینتراکشن های پروتئین-پروتئین

ارزیابی نشانگرها

کمیت نوکلئیک اسید

اینتراکشن های مولکولی

فعالیت آنزیمی

سمیت سلولی

کمیت ATP

ایمنی‌سنجی

کشف دارو

در حالیکه پلیت ریدر عموما به موارد گفته شده در بالا اشاره دارد،ابزارهای متنوع دیگری نیز در دسترسند.چند نمونه از دستگاه‌هایی که با فرمت میکروپلیت ریدر کار می‌کنند عبارتند از:

-پلیت ریدر های ELISPOT: برای شمارش لکه‌های رنگی که در دوره سنجش ELISPOT شکل می‌گیرند، استفاده می‌شوند.

– High-content screening (HSC): سیستم‌های غربالگری که هر چاه را برای ردیابی جمعیت سلولی با وضوح بالا تصویرسازی می‌کنند.

-ابزارهای بدون لیبل که از میکروپلیت‌های تخصصی برای اندازه‌گیری وقایع اتصال، بدون استفاده از نشانگر های شیمیایی استفاده می‌کنند.

 

Gel documentation system

 Gel documentation به ابزاری گفته می‌شود که به طور گسترده در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی برای تصویرسازی و مستندسازی اسید نوکلئیک و پروتئین‌های نشاندار شده در ژل های پلی آکریلامید یا آگارز یا سلولز مورد استفاده قرار می گیرد. این ژل ها به طور معمول توسط اتیدیوم برومید یا سایر رنگ‌های اسید نوکلئیک مانند GelGreen،رنگ می شوند. سیستم ها بسته به توان و نوع نمونه ، تنظیمات متنوعی دارند. به طور کلی، یک ژل داک شامل یک منبع نور ماوراء بنفش (UV)، یک هود یا اتاق تاریک برای محافظت از منابع نوری خارجی و محافظت از کاربر در برابر اشعه ماوراء بنفش، و یک دوربین CMOS برای ثبت تصویر است. ژل الکتروفورز در اتاق تاریک قرار می‌گیرد و نور (عموما فلورسانس) به ژل تابانده می‌شود؛ در نتیجه نشانگر هایی که به پروتئین یا DNA متصل شده و نسبت به نور حساسیت نشان می‌دهند،با تابش نور مرئی،پروتئین و یا DNA را بصورت رنگی نشان می‌دهند.و دوربین مخصوص عکس آن را ثبت میکند؛ سپس اطلاعات مربوطه به وسیله‌ی نرم افزار های خاص قابل بررسی است.

مدلهای تصویری که اخیراً تولید شده اند همچنین شامل ویژگی هایی برای کنترل انواع فلورسانس و لومینسانس با دوربین هایی هستند که تا 60- درجه سانتیگراد خنک شده اند. سایر ویژگی های پیشرفته عبارتند از: چاپ سریع روی دوربین و اتصال به Wi-Fi جهت کنترل توسط تلفن های هوشمند و تبلت.

کاربردها دستگاه الایزا ریدر 

تصویربرداری از ژل و بلات

 شمارش کلنی

 ایمنی‌سنجی

 تشخیص پروتئین

 تعیین تغییرات پس از ترجمه

 الکتروفورز دو بعدی

 کمیت پروتئین

انواع سیستم های ژل Doc

 نوع سیستم های مستندسازی ژل مورد نیاز آزمایشگاه، بستگی به روش کاربرد و تشخیص دارد.

 کِمی‌لومینسانس: به طور کلی برای وسترن بلات مورد استفاده می گیرد.

ردیاب های اتیدیوم برمید دیجیتال/CCD ، مادون قرمز، کِمی‌لومینسانس، فلورسانس 3 رنگ، چگالی سنجی و نور مرئی در دسترسند تا خوانش کمی از نوارهای اسید نوکلئیک و پروتئین، بلات های نقطه ای و میکروپلیت ها انجام گیرد.

 رادیوگرافی خودکار فیلم: برای رادیوایزوتوپ ها استفاده می شود.

 لیزر: حساسیت بالا و اندازه گیری دقیق برای رادیوایزوتوپ ها و انعطاف پذیری در انتخاب فیلترهای انتشار ؛ از جمله فیلترهای سفارشی برای رنگهایی مانند Cy.

Multiplex: چندین سیگنال فلورسنت را همزمان و در همان آزمایشات تشخیص داده و تصویر می‌کند و یا سیگنال های رادیوایزوتوپی، لومینسانس و رنگ سنجی را تشخیص می‌دهد.

Phosphoimager: حساسیت پیشرفته برای کاربردهای فلورسانس چندگانه و رادیو ایزوتوپ ها، انعطاف در انتخاب فیلترهای انتشار، از جمله فیلترهای سفارشی.

اگر به رشته زیست شناسی علاقه مند هستید، خوشحال میشیم دیگر مقالات سایت رو مطالعه بفرمایید.

گردآورنده : خانم لیلا تنهایی

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح آنزم های محدود کننده پرداخته است. برگرفته شده از کتاب کلون سازی ژن های پروفسور براون.

آنزیم محدود کننده چیست؟

 

پس از نمونه های خالص DNA گام بعدی در کلون سازی ژن ساختن مولکول DNA نوترکیب است برای تولید این مولکول نوترکیب باید حامل DNA کلون سازی در محل های خاصی بریده و با روش کنترل شده ای به هم وصل شوند برش و اتصال دو نمونه از روش های دستکاری DNA است .تقریبا تمام روش های دستکاری DNA با استفاده از آنزیم های خالص انجام می شوند . این آنزیم ها درون سلول در فرآیند های اساسی مانند همانندسازی و رونویسی DNA، شکستن DNA، ترمیم DNA جهش یافته و انجام نوترکیبی بین مولکول های DNA متفاوت عمل می کنند پس از خالص کردن آن ها از عصاره سلولی بسیاری از این آنزیم ها را می توان وادار کرد که واکنش های طبیعی خود یا مشابه آن را در شرایط آزمایشگاهی انجام دهند. اگرچه غالب این واکنش های آنزیمی واکنش های ساده ای  هستند ولی بیشتر آن ها با روش های معمول قابل انجام نیستند، بنابراین آنزیم های خالص در مهندسی ژنتیک بسیار مهم هستند و صنعت بزرگی برای تهیه، تعیین خصوصیات و فروش آن ها به وجود آمده است تولیدکنندگان تجاری آنزیم های با خلوص بالا ، خدمت مهمی به زیست شناسان مولکولی ارائه می دهند. مهندسی ژنتیک یکی از اهداف مهم تولید ژن یا فراورده آن به صورت انبوه است. به این منظور آن ها ژن را از جاندار جدا کرده و در یک جاندار ساده مانند باکتری تکثیر می دهند. برای جدا کردن ژن اولیه از سلول باید از یک آنزیم برای برش آن استفاده کنیم. این آنزیم، آنزیم محدود کننده نام دارد. آنزیم محدودکننده یا اندونوکلئاز مختص به پروکاریوت ها است. و بصورت یک عملکرد دفاعی دربرابر عوامل خارجی عمل می کند. این آنزیم ها به صورت اختصاصی عمل می کنند و هریک ناحیه ای خاص در DNA را شناسایی می کند و برش می دهند. این آنزیم ها به 4 گروه تقسیم می شوند. نوع ساختار، جایگاه شناسایی، چگونگی برش ویژگی هایی است که این 4 دسته را از هم متمایز می کند.

تفاوت اندونوکلئاز و اگزونوکلئاز

نوکلئاز ها : نوکلئازها با شکستن پیوند های فسفودی استر متصل کننده نوکلئوتید ها در رشته DNA، باعث تجزیه DNA می شوند، دو نوع مختلف نوکلئاز وجود دارد:

 اگزونوکلئاز چیست؟

 اگزونوکلئاز: نوکلئوتید ها را یک به یک از انتهای مولکول DNA جدا می نمایند.

اندونوکلئاز چیست؟

اندونوکلئاز: قادر به شکستن پیوند های فسفودی استر داخلی مولکول DNA هستند.  

تفاوت اصلی بین اگزونوکلئاز های مختلف، تعداد رشته هایی است که هنگام عمل بر مولکول دو رشته ای ، تجزیه می کنند برای گروه بندی اندونوکلئاز از معیار یکسانی استفاده می شود. اندونوکلئاز S1 فقط تک رشته ای ها را می شکند. درحالی که آنزیم دئوکسی ریبوکلئاز 1که از پانکراس گاو استخراج می شود، هر دو نوع مولکول دو رشته ای و تک رشته ای را برش می دهد. آنزیم DNase1 غیراختصاصی است ،چون می تواند DNA را در هر یک از پیوند های فسفودی استر درونی مورد حمله قرار دهد و نتیجه اثر طولانی مدت آن برDNA، مخلوطی از مونوکلئوتید ها و الیگونوکلئوتیدی بسیار است. از طرف دیگر گروه خاصی از آنزیم ها که اندونوکلئاز های محدودگر نامیده می شوند، DNA دو رشته ای را در تعداد محدودی جایگاه شناسایی ویژه می شکنند .

کشف و عملکرد اندونوکلئاز های محدودگر

مشاهده اولیه ای  که در نهایت منجر به کشف اندونوکلئاز های محدودگر شد، در اوایل دهه 1950 صورت گرفت. در این بررسی نشان داده شد که بعضی از سویه های باکتری ها در مقابل آلودگی به فاژها مصونیت دارند ، پدیده ای که محدودیت تنظیم شونده توسط میزبان نامیده می شود. مکانیسم این محدودیت خیلی پیچیده نیست، اگرچه فهم کامل آن بیش از 20 سال طول کشید. محدودیت بدین دلیل اتفاق که باکتری داری آنزیمی است که DNA فاژ، قبل از این که فرصتی را برای همانندسازی و هدایت ساخت  ذرات فاژ جدید بدست بیاورد، تخریب می کند. تجزیه DNA خود باکتری کشنده است، ولی به علت داشتن گروه های متیل اضافی که عمل آنزیم های تجزیه کننده را مهار می کنند، در مقابل آنزیم محافظت می شود. این آنزیم های تجزیه کننده اندونوکلئاز های محدودگر نامیده می شوند و توسط بسیاری و شاید تمام گونه های باکتری ساخته می شوند.

انواع آنزیم های محدود کننده

تاکنون بیش از 2500 نوع مختلف از آن ها جداسازی شده و بیش از 300 نوع از آن ها برای استفاده در آزمایشگاه در دسترس است. سه دسته مختلف از آنزیم های محدودگر مشخص شده اند که هر کدام با تفاوت جزیی در عملکردشان قابل تشخیص هستند. نوع 1 و 3 بسیار پیچیده هستند و نقش محدودی در مهندسی ژنتیک دارند. از طرف دیگر نوع 2 اندونوکلئاز های محدودگر، آنزیم های برشی هستند که در کلون سازی ژن بسیار اهمیت دارند.

اندونوکئاز ها ی محدودگر نوع 2، DNA را در توالی خاصی برش می دهند: ویژگی اصلی اندونوکلئاز های محدودگر نوع 2 این است که دارای یک توالی شناسایی خاص هستند و مولکول DNA را در آن توالی برش می دهند. یک آنزیم خاص، DNAرا در توالی شناسایی ونه در هیچ جای دیگر برش می دهد. برای مثال، آنزیم اندونوکلئاز محدودگری با نام Pvu1 ،DNA را فقط در محل نوکلئوتید شش تایی CGATCG می برد. در مقابل، آنزیم دیگری از همین باکتری به نام Pvu2 در محل یک شش تایی CAGCTG برش را انجام می دهد 

گردآورنده: سرکار خانم آیدا مظفرزاده

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح کاریوتایپ و کاربردهای آن پرداخته است

کاریوتایپ چیست؟

به بیان ساده می توان گفت کاریوتایپ  تصویری است که از کروموزوم های یک فرد تهیه می شود. که با در نظر گرفتن شکل و اندازه و تعداد آن‌ها، موقعیت سانترومرها، الگوی اتصال، هرگونه تفاوت بین کروموزوم‌های جنسی، و هرگونه ویژگی فیزیکی دیگر منظم شده‌اند.

کاریوتایپینگ یک روش آزمایشگاهی است که به پزشک شما این را امکان می دهد تا مجموعه کروموزوم های شما را مورد بررسی و معاینه قرار دهد. “Karyotype” در واقع به مجموعه ‌ای حقیقی از کروموزوم ها که قرار است مورد بررسی قرار گیرد، اشاره دارد. بررسی کروموزوم ها از طریق کاریوتیپ به پزشک شما اجازه می دهد تا تشخیص دهد که آیا ناهنجاری یا مشکلات ساختاری در کروموزوم‌هایتان وجود دارد یا خیر.

کروموزوم‌ها تقریبا در اکثر سلول‌های بدن شما وجود دارند. آنها حاوی ماده ژنتیکی هستند که از والدین شما به ارث رسیده است. کروموزوم ها متشکل از DNA هستند و نحوه تکامل هر انسانی را تعیین می کنند. هنگامی که یک سلول تقسیم می شود، باید مجموعه کاملی از دستورالعمل های ژنتیکی را به هر سلول جدیدِ حاصله، منتقل کند. وقتی سلول در روند تقسیم قرار نمی گیرد، کروموزوم ها به شکلی گسترده و غیر سازمان یافته در سلول حاضر هستند. در حین تقسیم، کروموزوم های موجود در این سلول های جدید به صورت خطی در خط‌ استوای سلول قرار می گیرند.

آزمایش کاریوتیپ، این سلول های تقسیمی را بررسی می کند. جفت کروموزوم ها با توجه به اندازه و مورفولوژیشان مرتب می شوند. این ویژگی به پزشک شما کمک می کند تا به راحتی تشخیص دهد که آیا کروموزوم هایتان از بین رفته یا آسیب دیده اند یا خیر .

 کاربردهای کاریوتایپ

 

یک وضعیت ژنتیکی را می‌توان از نشانه‌هایی مثل تعداد کروموزوم ها، کروموزوم های نادرست مرتب شده یا کروموزوم های دریافت.  شرایط ژنتیکی بسیار متفاوتی در دنیا وجود دارد، اما دو نمونه از آنها نشانگان داون و سندرم ترنر است.

از کاریوتایپ افراد می توان برای تشخیص انواع اختلالات ژنتیکی استفاده کرد. به عنوان مثال، نارسایی زودرس تخمدان یک خانم ممکن است در اثر نقص کروموزومی ایجاد شده باشد که آزمایش کاریوتایپ میتواند آن را مشخص کند. داشتن این کروموزوم می تواند لوسمی میلوژن مزمن (CML) را نیز نشان دهد. برای تشخیص ناهنجاری های ژنتیکی مثل سندرم کلاینفلتر که نشان دهنده نقایص جدی هنگام تولد است، می توان قبل از زایمان از نوزادان تست کاریوتایپ گرفت. در سندرم کلاینفلتر، پسری با کروموزوم X اضافی متولد می شود.

تمهیدات و خطرات آزمایش کاریوتایپینگ 

 

تدارکات مورد نیاز برای کاریوتیپ بستگی به روشی دارد که پزشک شما برای گرفتن نمونه از سلولهای خونی شما برای آزمایش استفاده خواهد کرد. نمونه ها را می توان به روش های مختلفی دریافت کرد، از جمله:

  • آزمایش و کشت بافت خون
  • بیوپسی مغز استخوان، که شامل گرفتن نمونه از بافت اسفنجی در داخل استخوان های خاص است
  • آمنیوسنتز، که شامل گرفتن نمونه از مایع آمنیوتیک از رحم است

البته گاهاً این روش های آزمایشگاهی همراه با عوارض بوده که البته وقوع آن بسیار نادر است. مثلا گاهی خطر خونریزی و عفونت از ترشحات خون یا بیوپسی مغز استخوان وجود داشته و آمنیوسنتز خطر بسیار کمی از سقط جنین را به همراه دارد.

اگر تحت آزمایش شیمی درمانی باشید، ممکن است کمی از وضوح آزمایش شما کاسته شود. شیمی درمانی می تواند کروموزومهای فرد را کمی تخریب کند‌، که در تصاویر حاصل از آزمایش کاریوتیپ ظاهر می شود.

انواع کاریوتایپ

اولین قدم برای کاریوتایپ، گرفتن نمونه ای از سلول های شما است. سلول های نمونه می توانند از تعدادی بافت مختلف گرفته شوند. این بخش‌ها می تواند شامل موارد زیر باشد:

  • مغز استخوان
  • خون
  • مایع آمنیوتیک
  • جفت

نحوه انجام آزمایش کاریوتایپ

نمونه برداری با توجه به اینکه در کدام ناحیه از بدن مورد آزمایش قرار می گیرد، می تواند با استفاده از روشهای مختلف انجام شود. به عنوان مثال، در صورت نیاز به آزمایش مایعات آمنیوتیک، پزشک از آمنیوسنتز برای جمع آوری نمونه استفاده می کند.

پس از نمونه برداری، نمونه را در یک ظرف آزمایشگاهی قرار می دهند که سلول ها در آن رشد یابند‌ یک تکنسین آزمایشگاه سلول های نمونه را گرفته و آنها را رنگ آمیزی می کند که باعث می شود پزشک شما کروموزوم ها را در زیر میکروسکوپ مشاهده کند.

این سلول‌های رنگ آمیزی شده، برای بررسی ناهنجاری های احتمالی تحت میکروسکوپ خاصی مورد بررسی قرار می گیرند. ناهنجاری ها می تواند شامل موارد زیر باشد:

  • کروموزوم های اضافی
  • کروموزوم های از دست رفته
  • بخش هایی که فاقد کروموزوم هستند
  • بخش های اضافی یک کروموزوم
  • بخش هایی که از یک کروموزوم جدا شده و به دیگری پیوستند

تکنسین آزمایشگاه می تواند شکل، اندازه و تعداد کروموزوم ها را ببیند. این اطلاعات در تعیین وجود ناهنجاری های ژنتیکی از اهمیت بالایی برخوردار است.

 

تفسیر نتیجه آزمایش کاریوتایپ

نتیجه آزمایش عادی 46 کروموزوم سالم را نشان می دهد. دو مورد از این 46 کروموزوم ، کروموزوم های جنسی است که جنسیت فرد مورد آزمایش را تعیین می کند و 44 مورد از آنها اتوزوم است. اتوزوم‌ها ارتباطی با تعیین جنسیت فرد مورد آزمایش ندارند. زنان دارای دو کروموزوم X هستند، در حالی که مردها یک کروموزوم X و یک کروموزوم Y دارند.

ناهنجاری هایی که در یک نمونه آزمایش مشاهده می شود، می تواند نتیجه هر تعداد سندرم یا شرایط ژنتیکی باشد. بعضی اوقات، در نمونه آزمایشگاه اختلال ایجاد می شود که در بدن و شرایط زندگی شما منعکس نشده است. آزمایش کاریوتایپ ممکن است تکرار شود تا ناهنجاری ها بطور دقیق‌تر بررسی شوند.

 

اگر به این مقاله علاقه مندید، مطالعه مقاله « بیماری اوتیسم» را به شما پیشنهاد می دهیم.

ویستاژن vistagene vistagene

گردآورنده : سرکار خانم فاطمه علیزاده ثانی

سایت ویستاژن در این مطلب یک نمونه  گزارش کار آزمایشگاه مبانی گیاه شناسی را برای شما در نظر گرفته است؛ تا علاوه بر آموزش نحوه نوشتن  گزارش کار آزمایشگاه ، اطلاعاتی نیز در مورد سلول و بافت گیاهی در اختیار شما عزیزان قرار دهیم.

نحوه نوشتن صحیح گزارش کار آزمایشگاه 

آزمایش شماره : 《1》

شماره گروه : _

نام و نام خانوادگی : _

نام استاد : _

نام آزمایش : مشاهده سلول گیاهی و پدیده تورژسانس و پلاسمولیز

ساعت کلاس: _

تاریخ انجام آزمایش: _

تاریخ تحویل آزمایش: _

گزارش کار آزمایشگاه گیاه شناسی

در آزمایش “مشاهده سلول گیاهی” بین دیواره سلولی و دیواره سیتوپلاسمی فاصله و فضایی وجود ندارد و لذا تفکیک بین این دو عملا غیر ممکن به نظر می رسد. دلیل این موضوع پدیده اسمز و نهایتا فشار آب درون سلولی (پتانسیل فشاری آب) است که باعث نزدیک شدن و چسبیدن پلاسمالما به دیواره سلولی می شود.

اپیدرم 

اپیدرم یا روپوست لایه بیرونی پوست است.اپیدرم مرزبندی اصلی در سطح بدن گیاه و یا جانور است و آن را در برابر محیط ایمن می کند.سلول های اپیدرمی سلول های پارانشیمی تخصص یافته هستند که زنده اند ولی دارای واکوئل و فاقد کلروپلاست هستند. (در فلس پیاز واکوئل رنگدانه آنتوسیانین را دارد.)

پدیده تورژسانس 

سلول در چنین محیطی آب جذب نموده و متورم می شود. چون در این شرایط فشار اسمزی سلول بالاتر از محیط اطراف آن می باشد و همیشه فشار اسمزی بالا، جاذب آب است؛ بنابراین سلول تمایل به جذب آب دارد.

پدیده پلاسمولیز 

سلول در چنین محیطی آب از دست داده و چروکیده می شود. چون در این شرایط فشار اسمزی محیط بالاتر از داخل سلول می باشد؛ بنابراین محیط جهت تعدیل فشار اسمزی آب مورد نیاز خود را از سلول می گیرد.

 

هدف آزمایش (معمولا با نام آزمایش یکی می باشد)

آشنایی با ساختمان سلولی گیاه و آشنایی با مفهوم تورژسانس و پلاسمولیز

وسایل مورد نیاز آزمایش گیاه شناسی

میکروسکوپ نوری _ لام _ لامل _ شیشه ساعت _ تیغ _ قطره چکان _ آب مقطر _ آب نمک(محلول NaCl) _ پیاز(ترجیحا پیاز بنفش رنگ)

مراحل انجام آزمایش گیاهی

در آزمایش اول ابتدا یک لایه پیاز را بر می داریم و با کمک تیغ اپیدرم آن را جدا می کنیم ؛ سپس روی شیشه لام یک قطره آب مقطر قرار می دهیم و بخش ۰کوچکی از اپیدرم را روی لام قرار می دهیم.سپس یه لامل را روی آن گذاشته و لام را زیر میکروسکوپ تنظیم میکنیم و بیانگر پدیده تورژسانس است.
برای مشاهده نمونه،ابتدا از عدسی با درست نمایی 4 استفاده می کنیم و بعد از می توانیم به ترتیب از عدسی با قدرت 10 و 40 استفاده کنیم.
(▪️نکته:در آزمایشگاه هایی که برای آموزش دانشجویان مورد استفاده قرار می گیرد به ندرت از عدسی 100 استفاده می شود.)
در آزمایش دوم با استفاده از قطره چکان دو یا سه قطره آب نمک غلیظ در یک طرف لام قرار می دهیم و مطابق آزمایش قبلی، بخش کوچکی از اپیدرم پیاز را روی لامل که حاوی آب نمک غلیظ است قرار می دهیم و سپس بعد از چند دقیقه لامل را روی شیشه لام قرار می دهیم و آن را زیر میکروسکوپ تنظیم می کنیم.
زمانیکه آب نمک زیر لامل کشیده می شود محیط غلیظ ایجاد نموده که این امر موجب از دست دادن آب سلول ها و در نتیجه جدا شدن غشایی پلاسمایی از دیواره سلولی می شود که بیانگر پدیده پلاسمولیز است.
▪️نکته :حال اگر با قطره چکان چند قطره آب خالص کنار لامل قرار دهیم محیط اطراف سلول ها رقیق شده که این امر باعث چسبیدن غشایی پلاسمایی به دیواره سلولی می شود و تورژسانس را می دهد.

نتایج کار و ترسیم مشاهدات

پس از انجام آزمایش اول مشاهده می‌کنیم تورم در سلول ایجاد شده که در این حالت فشاری به دیواره سلولی این فشار غشای پلاسمایی را محکم به دیواره سلولی چسبانده و در نتیجه سلول سخت و محکم شده است و سلول های گیاه به صورت فشرده در کنار هم قرار دارند،این پدیده تورژسانس نام دارد.

 

پس از انجام آزمایش دوم مشاهده می کنیم غشای پلاسمایی در بعضی نقاط از دیواره سلولی جدا شده که در چنین حالتی سلولها شادابی و تردی خود را از دست می دهند. این پدیده که عمل عکس تورژسانس به حساب می‌آید، پلاسمولیز می‌گویند.

 

● سوالات مربوط به آزمایش گیاه شناسی

1.چرا در آزمایش به جای پیاز بنفش از پیاز سفید استفاده نکردیم؟!
در این آزمایش از پیاز سفید رنگ هم می توانستیم استفاده کنیم اما یک مرحله به مراحل قبلی آزمایش افزوده می شد که باید پیاز را در محلول رنگی لوگل قرار می دادیم تا سلول رنگ آمیزی شود و برای سهولت کار از پیاز بنفش استفاده کردیم.

2. برای مشاهده نمونه با عدسی 100 چه باید کرد ؟!
هنگام استفاده از عدسی 100 باید از روغن ایمرسون استفاده کنیم و در صورتی که از این روغن استفاده نکنیم،هوا با ضریب شکست بالایش باعث پراکنده شدن پرتوها می شود و به علت فاصله کانونی عدسی،نور چندانی به آن نمی رسد.
همچنین استفاده از روغن ایمرسون باعث می شود که عدسی چشمی 100 از نمونه فاصله گرفته و از آسیب رسیدن به نمونه و عدسی جلوگیری می شود.
بعد از اتمام کار با عدسی 100 باید آن را با گریس تمیز نمود،زیرا در غیر این صورت روغن روی عدسی خشک می شود.

گردآورنده: جناب آقای حسن مسروری

 

vistagene vistagene 

 

سایت ویستاژن دانلود جزوه مروری بر ژنتیک مولکولی و مهندسی را در اختیار شما عزیزان قرار داده است.

دانلود پی دی اف pdf

جزوه_مروری_بر_ژنتیک_مولکولی_و_مهندسی

 

 

 

 

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح نحوه پدیداری دورگه های انسان و میمون پرداخته است.

خلق دورگه انسان و میمون !

دانشمندان در حال ساخت دورگه های انسان و میمون در چین هستند. ممکن است آنها با اختلاط سلول انسانی جهش بزرگ و جنجالی برداشته باشند. به گفته روزنامه اسپانیایی EL Pa تیمی از محققان در حال ایجاد جنین هایی هستند که جزئی انسانی و جزئی ژنوم میمون را دارند. در مصاحبه یک زیست شناس اسپانیایی که در آزمایشگاه کالیفرنیا کار می کند و با تحقیقات میمون در چین همکاری کرده است گفته شده هدف این آزمایش خلق یک موجود انسان-حیوان فرضی است. در این آزمایشات جنین میمون تشکیل می شود که سلول های انسان به آن اضافه شده است. در واقع ایده اصلی استفاده از حیواناتی است که اندام هایی مانند کلیه و کبد را دارا می باشند تا به عنوان منبع اندام برای پیوند استفاده شوند. در سال 2005 در ژاپن تحقیقاتی انجام دادند که در آن سلول بنیادی مغز استخوان را در جنین موش وارد کردند برای یک فرد خاص چنین سلول هایی با فرد سازگار خواهد بود بنابراین در صورت استفاده برای معالجه از عدم پذیرش بافت جلوگیری می شود و حیوان وسیله ای برای رشد اندام سلول ها بنیادی انسان خواهد بود این حیوان به عنوان یک میزبان و واسطه برای انسان است.

 

 

تفاوت کیمرا و دورگه ها 

هیبرید ها و کیمرا از نظر بیولوژیکی با یکدیگر تفاوت دارند. سلولی از یک کیمرا ماده ژنتیکی یکی از دو والد خود را دارد در حالی که در دو رگه ای مثل قاطر ماده ژنتیکی از هر دو والد گونه دریافت می شود.

دانشمندان علاقه مند به ایجاد نوع دیگری از هیبرید به نام جنین ترکیبی سیتوپلاسمی با هدف تولید سلول های بنیادی هستند برخی از دانشمندان با استفاده از فناوری برای غلبه بر کمبود تخمک های انسانی، تخمک های حیوانی با هسته سلول های سوماتیک انسان ترکیب کرده اند تا جنین هایی به نام جنین هیبریدی سیتوپلاسمی ایجاد کنند که از آنها می توان سلول های بنیادی را مشتق کرد. جنین ترکیبی سیتوپلاسمی یک دورگه محسوب می شود زیرا ماده ژنتیکی آن اگرچه بیش از 99%انسانی است از دو گونه انسان و حیوان سرچشمه می گیرد که جزء انسانی از هسته سلول سوماتیک و جزء حیوانی از میتوکندری موجود در سیتوپلاسم آن ناشی می شود.

کایمر حیوانی

Animal-chimera

محققان با تزریق سلول های بنیادی انسانی، از جمله سلول های بنیادی در مراحل مختلف رشد با هدف:

  • مطالعه ادغام سلول های بنیادی و متمایز
  • برای آزمایش پتانسیل رشد سلول های بنیادی انسانی یا مشتقات آنها
  • برای ارزیابی سودمندی و ایمنی بالقوه در پیوند سلول های بنیادی انسان برای معالجه بالینی یا امکان رشد بافت ها و اندام های انسانی در حیوانات را برای پیوند به انسان مطالعه می کند .

یک تیم تحقیقاتی از CRISPR بر روی پیش ساز های جنین موش استفاده کردند تا ژن هایی را که سلول ها را به پانکراس، قلب یا چشم تبدیل شود و هدایت می کنند، دور کنند سپس آنها این سلول های بنیادی را با سلول های بنیادی موش مجددا نوسازی کردند. که تحت هدایت ژن های خودشان به اندام های مربوطه تبدیل شود که حیوانات ترکیبی را توانستند در بزرگسالی زنده نگه دارند.

برای اولین بار بلمونته در سال 2017 موفق به عملی کردن  ساخت کیمرا شد تمرکز اولیه او ایجاد یک هیبرید انسانی با خوک ها بود که دارای اندام هایی با اندازه ما هستند از آن جا که خوک ها خیلی سریع پرورش می یابند و کم تر رادیکال است هرچند که ایده برداشت اعضای بدن انسان از این جانشین های انسان-خوک هنوز هم ناراحت کننده است . سپس تیم سلول های بنیادی انسان را وارد جنین خوک می کند که در خوک های مادر جانشین منتقل می شود تا حداکثر یک ماه رشد کنند اگرچه خوک-انسان جنین زنده مانده است میزان پیوند بسیار کم است ، از هر 10000 سلول حدود یکی از آنها انسانی بود شکاف تکاملی بین خوک ها و انسان بسیار بیش از این بود که کارآمد باشد.

حال می توانیم دلیل پیش رفتن به سمت کیمرای میمون را درک کنیم. میمون ها از نظر ژنتیکی بسیار به ما نزدیک هستند و از نظر تئوری می توانند بهتر عمل کنند. گفته ها حاکی از این است که چنین آزمایشاتی در جهت تولید جنین میمون به وسیله سلول بنیادی انسانی صورت گرفته است .برخی دانشمندان معتقدند که حتی اگر این آزمایشات انجام شده باشد رشد اعضای بدن میمون معنی ندارد زیرا رشد میمون زمان بر است و همچنین میمون ها اندام های بسیار کوچک تری دارند که با انسان های بزرگسال ناسازگار است.در حالی که دیگر دانشمندان عقیده دارند حتی بدون رشد کامل این آزمایش بسیار باارزش است و می تواند به ما بیاموزد که چند نوع سلول بنیادی یا روش هایی برای ایجاد یک کیمرا باید استفاده کنیم. تکنیک استفاده از کیمرا شامل تزریق سلول های بنیادی انسان به همراه جنین کیمرا است چون کمیرا انسان-خوک نتوانست ژنوم انسان را نگه دارد احتمال اینکه میمون در این آزمایش موفق شود زیاد است. محققان سوالات اساسی علمی بیشتری در ذهن دارند ورود سلول های انسانی به جنین میمون می تواند مورد توجه قرار گیرد. دانشمندان همچنین از تکنولوژی ویرایش ژن برای غیرفعال کردن اطلاعات نوع خاصی از سلول های جنین حیوان استفاده می کنند .

 

مغزهای هیبریدی

تصور کنید مغز حیواناتی که با فعایت های زیستی انسانی کار می کنند چقدر می تواند ترسناک باشد؟

در سال 2014 دانشمندان موش هایی با سلول های غیرعصبی مغز انسان هیبریدی ایجاد کردند که بیش از نیمی از مغز را تقویت می کند در مقایسه آستروسیت موش ها با انسان، انسان ها 20 برابر بزرگ ترند و 100 برابر بیشتر اتصالات عصبی را به همراه دارند بدین معنی که آنها می توانند مغز را بهتر هماهنگ کنند .

هیبرید ها باهوش تر بودند؛ وقتی یک تست حافظه از موش ها صورت گرفت آنها نسبت به حالت نرمال خود 4 برابر بهتر عمل کردند .

در آزمایشی دیگر چین تلاش می کند  ژن های انسانی را در میمون ها درج کند هدف این بود که ریشه های تکاملی هوش را کشف کنند و تیم می خواست ببیند که آیا می تواند مغز میمون را به طور مصنوعی به مغز انسان تبدیل کند یا چیزی شبیه به مغز انسان بوجود بیاورد؟ مدت بیشتری طول می کشید تا مغز هیبرید ها رشد کند اما اندازه هایی تقریبا مشخص و هم اندازه میمون عادی داشتند. هیبرید ها در تست حافظه کوتاه مدت عملکرد بهتری داشتند اما نتیجه گیری بسیار دور از نتیجه ایده آل بود.

میمون ها در نردبان تکاملی از موش ها بسیار به انسان  نزدیک ترند و بسیاری از این امر می ترسند . ترکیب آنها با ژن های انسانی به عملکرد مغز می تواند به طور ناخواسته به آنها احساس قدرت خودآگاهی بیشتری بدهد و این سوال ایجاد می شود که آیا این میمون ها درحقیقت زندانیانی هستند که تحت اسارت قرار دارند و عواقب انسانی شدن آنها چیست؟ و این دلیلی است که باعث خودداری از پرورش چنین هیبریدی می شود.

کاربرد دورگه انسان و میمون

درمان بیماری 

در بنیاد زیست پزشکی در کارائیب دانشمندان درحال پیوند نابالغ هستند. سلول های مغزی انسان در اعماق مغز میمون ها گره خورده است. هدف آنها تنها یک چیز است : درمان بیماری پارکینگسون. آن ها سلول های مغزی نابالغ انسان را به داخل بدن میمون  تزریق می کنند. سپس به بررسی  ناحیه تولید دوپامین از مغز میمون ها می پردازند  که آیا سلول ها می توانند رشد کنند و چگونه  تولید دوپامین را افزایش دهند. (میمون ها از خوی وحشی خود گرفته شده اند).

De Los Angeles در یک مقاله علمی معتقد است مغزهای ترکیبی میمون انسانی به طور بالقوه بسیار موثر است . بیماری آلزایمر؛ علی رقم بهترین تلاش ها ما هنوز یک مدل حیوانی نداریم که بتواند نمونه های لین اختلال را مجددا تکرار کند و این یک تجمع گسترده از میلیون ها انسانی است که از این بیماری رنج می برند .از نظر تئوری برای بیماری هایی که مدل ابتدایی آنها به اندازه کافی خوب نیستند ساختن کیمرا انسان و میمون می تواند الگوی مناسبی برای بیماری های مغزی باشد.

در ایالات متحده آمریکا موسسات ملی سلامت می گویند منابع مالی فدرال هرگز نمی تواند برای خلق جنینی که ترکیبی از میمون و انسان است مورد استفاده قرار گیرد با این حال این قانون در چین وجود ندارد که احتمالا به این دلیل انجام این تحقیقات در آنجا می باشد . تا به حال هیچ موجودی که بخشی انسان و بخشی میمون باشد بوجود نیامده است. بجای آن تنها به ترکیب جنین اجازه داده می شود برای چند هفته در آزمایشگاه رشد کنند و در این زمان آنها می توانند بر روی کیمرا مطالعه داشته باشند.

در آمریکا در سال 2005 آکادمی های ملی دستورالعملی را در مورد کیمرا منتشر کرد هرچند که اجرای این قوانین الزامی ندارد ولی به احتمال زیاد آنها می تواند تاثیری جدی بر تحقیقات داشته باشد .مقررات مربوط به تحقیقات کیمرا عموما از پروژه های در حال اجرا عقب مانده است و در مرزها بین الملی قوانین متفاوتی دارد مثلا در عین حال که در ایالات متحده آمریکا و کانادا ممنوع است در چین تحقیقات ادامه دارد. به دلیل اینکه کیمرا انسان و حیوان شامل سلول های انسانی حتی بافت ها یا اندام آن است از نظر اخلاق انسانی نگران کننده است. دغدغه های اخلاقی بحث برانگیز است و ما را دچار چالش می کند. از آنجا که کیمرا در شرایط آزمایشگاهی برای تحقیقات ایجاد شده اند این سوال پیش می آید که اساسا کیمرا چه چیزی یا چه کسی است؟ زیرا آنها در آزمایشگاه و به هدف تحقیق خلق شده اند. آیا آنها حیوان آزمایشگاهی هستند یا کیمرایی هستند که در نهایت مانند انسان پرورش پیدا می کنند. مباحث اخلاقی نگرانی به کیمرا به دو گروه تقسیم می شوند:

  1. مخالف کامل با این نوع تحقیقات
  2. کسانی که نگرانی در مورد روش های خاص و نتیجه هایی که ممکن است در پی داشته باشد،دارند.

در مورد اول آنها کسانی هستند که اعتقاد دارند تحقیق کیمرا انسان-حیوان بهتر است هرگز اجرا نشود.

 

دلایل مخالفت: این تحقیقات در مورد جنین انسان است حتی اگر این جنین ها از بین نروند مواد ژنتیکی انسان و حیوان را با نتیجه ناشناخته و شاید ناآگاهانه ترکیب می کند .

معاون دبیرخانه فعالیت های حرفه ای زندگی:من فکر می کنم اساسا غیر اخلاقی است که موجودی را خلق کنیم که نمی توانیم برای آن وضعیتی را مشخص کنیم و ما یک معضل غیرقابل حل در مورد نحوه درمان این حیوان خواهیم داشت.

استادیار کلینیک مایو: پروژه های تحقیقاتی که کیمرا انسان و حیوان خلق می کند خطر اکوسیستم های مزاحم را ایجاد می کند و سلامتی را به خطر می اندازد و یکپارچگی گونه ها را بهم می ریزد ما باید محتاط باشیم تا به زنگی حیوانات تجاوز نکنیم .

دلیل دیگر نادیده گرفتن رفاه حیوانات مهاجم و گونه های حیوانات است. HSUS از درد و پریشانی که حیوانات ممکن است تحت آزمایش قرار گیرند نگران است.جامعه مسئول بهزیستی که نتیجه این نوع آزمایشات است قرار می گیرد.

عده ای عقیده دارند این تحقیقات مرزهای گونه را رد می کند و حیوانات حق دارند بدون اینکه دستکاری شوند زندگی کنند و همچنین چون روش های مشابهی که به پیشرفت پزشکی کمک کرده است ایجاد شده با انجام این آزمایشات مخالف اند.

تولید کیمرا بدون ثبت اختراع هنوز قانونی است اما ممکن است از نظر مالی امکان پذیر نباشد تا یک شرکت زیست فناوری برای تولید محصولات آن را توسعه دهد.

شامپانزه ها 98% از ژنوم انسان را به خود اختصاص داده اند و یک شامپانزه کاملا بالغ از توانایی های ذهنی و هوشی معادل یک انسان 4 ساله برخوردار است .ادغام جنین انسانی و شامپانزه که محققان می گویند عملی است می تواند موجودی را چنان انسانی تولید کند که در مورد نحوه زندگی او سوال می شود آیا باید برای آزادی خود نوعی آزمون انسانیت را پشت سر بگذارد ؟ آیا مجبور به انجام کار های زایمان می شود یا برای انجام عمل جراحی خطرناک مورد استفاده قرار می گیرد؟

در گروه دوم با وجود این مسائل برخی معتقدند اگر مغز یک کیمرا از نورون های انسانی با ساختار مناسب تشکیل شده باشد باید بررسی نمود آیا مغز و ذهن انسان می تواند در بدن حیوان دیگری توسعه یابد؟

محققان در آزمایشی سلول بنیادی عصبی انسان به جنین ها موش های برای مطالعه بیماری عصبی بودند نتایج اولیه موش هایی با مغز 1%انسانی بودند اما محققان می توانند این درصد را به 100% در آزمایشگاه افزایش دهند. آنها پیش بینی می کنند که ساختار های مغز مطمئنا هم اندازه با موش های عادی است .اگر در موش ها این تغییرات بوجود بیاید قطعا تحقیقات متوقف خواهد شد.

گردآورنده : سرکار خانم آیدا مظفرزاده

سایت ویستاژن در این مقاله به معرفی سندرم آنجلمن پرداخته است.

پیشینه سندرم آنجلمن

در سال 1965، دکتر هری آنجلمن، یک پزشک انگلیسی، ابتدا سه کودک را با ویژگی های خود شرح داد وی خاطرنشان کرد: همه یک حرکت سخت، تند و تیز، اختلال در هنگام صحبت، بیش از حد خنده و تشنج داشتند. سرانجام پرونده های دیگری منتشر شد اما بیماری در آن زمان بسیار نادر بود و بسیاری از پزشکان به وجود آن شک داشتند. اولین گزارش ها از شمال آمریکا در اوایل دهه 1980 ظاهر شد. دکتر آنجلمن موارد زیر را در مورد کشف این موضوع بیان می کند:

“تاریخ پزشکی پر از داستان‌های جالب در مورد کشف بیماری ها است که سندرم آنجلمن یکی از این داستانهاست. این تقریباً به طور اتفاقی نزدیک به سی سال پیش  سه فرزند معلول در زمان های مختلف در بخش کودکان من در انگلیس پذیرفته شدند. آن‌ها معلولیت گوناگونی داشت و اگرچه در نگاه اول از شرایط مختلف رنج می بردند احساس کردم یک دلیل مشترک برای بیماری آنها وجود دارد. این تشخیص کاملاً بالینی بوده است زیرا به رغم تحقیقات فنی که امروزه بیشتر شده است، نتوانستم اثبات علمی را برای آن داشته باشم با این حال، هنگام تعطیلات در ایتالیا، من به طور اتفاقی در موزه Castelvecchio نقاشی در ورونا روغنی را دیدم به نام … پسری با عروسک. پسرانی با  چهره های  خندان که شبیه بیماران من به تصویر کشیده شده بودند. حرکات تند و زننده به من ایده نوشتن مقاله ای درباره سه کودک با عنوان بچه های عروسکی  را داد. این اسمی نبود که همه والدین را خوشحال کند، اما به عنوان ابزاری برای ترکیب این سه کودک بود. بیماران به یک گروه واحد تبدیل شدند و این اسم به  نام سندرم آنجلمن تغییر یافت.

سندرم آنجلمن و پرادر ویلی

 

این مقاله منتشر شده در سال 1965 بود و پس از برخی علاقه های اولیه تقریباً فراموش تا اوایل دهه هشتاد. “در سال 1987، الن مگنیس، پزشک مرکز علوم بهداشتی اورگان، کودکانی را شناسایی کرد: ریز ساختارهای کروموزوم 15 که انتظار داشتند سندرم پرادر ویلی را داشته باشند. با این حال، این کودکان دچار تشنج و تأخیر در رشد شدید بودند، که انتظار نمی رود ویژگی هایی برای سندرم پرادر ویلی باشد. او خیلی سریع فهمید که این کودکان در شماره کروموزوم  15 مشتق شده مادری دچار مشکل اند در حالی که در سندرم پرادر ویلی حذف همیشه بر روی کروموزوم 15  پدری مشاهده شده است این یک کشف مهم بود و در نهایت راه را برای تعیین چند مورد هموار کرد. مثلا در یک فرد سالم آلل مادری فعال و آلل پدری خاموش می شود، حال اگر در این فرد آن آلل مادری هم دستخوش تغییر شود، سندرم آنجلمن به وجود می آید. میزان بروز سندرم آنجلمن: حدود ۱ در ۱۰۰۰۰ تا ۲۰۰۰۰ نفر می باشد.

در سال 1997 جهش در ژن UBE3A واقع در کروموزم 15 به عنوان علت AS شناخته شد تمام مکانیسم هایی که به عنوان عامل AS شناخنه می شوند باعث اختلال غیرفعال شدن یا عدم وجود این ژن می شوند. چندین مکانیسم ژنتیکی وجود دارد که می تواند روی کروموزم 15 مادری اختلال ایجاد کند.

علایم سندرم آنجلمن

بیش فعالی

بیش فعالی یک رفتار بسیار رایج در AS است و بهتر است به عنوان hypermotoric  توصیف شود. اساسا همه کودکان سندروم دارای این افرایش حرکتی هستند و به نظر می رسد زن و مرد به یک اندازه تحت تاثیر قرار می گیرند نوزادان و کودکان نوپا ممکن است فعالیت های به ظاهر ناپایدار داشته باشند و مرتبا دست یا اسباب بازی خود را در دهان خود نگه می دارند حرکت می کنند در موارد شدید حرکت مداوم می تواند باعث کبودی و ساییدگی تصادفی شود. اصلاح رفتار به کاهش یا از بین بردن این رفتار ناخواسته کمک می کند.

 

چهره خندان و شاد

مشخص نیست که چرا خنده انقدر در AS شایع است اخیرا پیشرفت در تصویر برداری عصبی  به محققان در کشف قشر مغز کمک کرده است که نشان می هد منطقه ای در آن بیشتر درگیر جنبه های  حرکتی طنز است و متاسفانه CT scan و MRI هیچ نقصی را در مغز این افراد نمی تواند نشان دهد. چندین نوع بیان چهره یا رفتار یشخصیت نوزاد را توصیف می کند. انفجار خنده در 70% در یک مطالعه رخ داده است غالبا رفتار های شاد در رفتار آن ها بارز است در موارد نادر حال و هوای شاد ظاهری زودگذر است زیرا تحریک پذیری و بیش فعالی و گریه و فریاد یا جیغ کوتاه  ویژگی شخصیت غالب آنهاست.

زبان و گفتار

به نظر می رسد برخی از کودکان AS  درک درستی دارند که بتوانند صحبت کنند اما حتی در بالاترین سطح عملکرد گفتار مکالمه ایجاد نمی شود . طبق گزارشات بین 1-3 کلمه و در گزارشی دیگر حدود 39% بیش از 4 کلمه صحبت کردند. البته توجه نشده است که آیا این کلمات بطور معناداری استفاده شده اند یا خیر. این کودکان ممکن است مهارت های کلامی و شناختی بالاتری داشته باشند در بعضی مواقع ممکن است استفاده از 10-20 کلمه رخ دهد اگرچه تلفظ ممکن است دست و پا شکسته باشد .تحول گفتار در AS تحول کمی دارد . مهارت زبانی کودکان AS بسیار متفاوت است و پیشرفته ترین کودکان قادر به یادگیری برخی نشانه ها هستند . در روش درمانی استفاده از وسایلی مانند تابلوی ارتباطی در واقع به صورت تصویری برای  مبتلایان است .

ارتباطات

همه کودکان مبتلا به AS  ارتباط برقرار می کنند بعضی از آن ها موثرتر از سایرین. هنگامی که آنان قادر به برقراری ارتباط نیستند ممکن است کودکان به رفتار های مشکلی مانند کشیدن مو فشار دادن ضربه زدن و گاز گرفتن برای بیان متوسل شوند. قریب به اتفاق این رفتار ها تلاش های ارتباطی است که در شرایطی رخ می دهد که افراد از دسترسی به سایر روشهای مرسوم و مناسب اجتماعی برای بیان خود بی بهره باشند می توان انتظار داشت که این موارد را ببینیم .

هنگامی که افراد ابزار های جایگزین برای انتقال همان اهداف مانند حرکات و اشکال دیگر را یاد بگیرد این رفتار ها محو می شوند. اگر فعال کردن پیام در یک وسیله ارتباطی منجر به همان نتیجه دلخواه شود کودکان دیگر نیازی به فریاد زدن ندارند.

خواب کم

گزارشات والدین و مطالعات اخیر نشان می دهد که کاهش نیاز به خواب و چرخه خواب و بیدار ماندن غیر طبیعی در این بیماران رایج است . که باید از یک برنامه درمانی رفتاری بهره مند می شود به نظر می رسد استفاده دوز کم ملاتونین یک ساعت قبل خواب نیز در بعضی از کودکان کمک کننده است. داروها آرام بخش هم می تواند موثر باشد. عده ای هم خواب خوبی دارند و دارویی مصرف نمی کنند.

تشنج

بیش از 90% از افراد مبتلا به AS گزارش شده است که تشنج دارند . کم تر از 25% قبل از 12 ماهگی دچار تشنج می شوند. بیش تر آن‌ها قبل 3 سالگی شوع شده اند. در مورد دارو های  تشنج هیچ توافقی وجود ندارد. استفاده از داروهای واحد ترجیح داده می شود اما پیشرفت تشنج شایع است. برخی از کودکان با تشنج غیرقابل کنترل در رژیم کتوژنیک قرار گرفته اند و این ممکن است در بعضی موارد مفید باشد کودکان مبتلا به  AS دلیل ناهنجاری های حرکتی یا توجه آن‌ها در معرض خطر بیش از حد دارو ها قرار دارند.

گردآورنده : سرکار خانم آیدا مظفرزاده

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش PCR پرداخته است.

PCR چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase chain reaction) یا PCR، در زیست شناسی مولکولی برای ایجاد تعداد زیادی رونوشت از توالی های کوتاه DNA  یا ژن بکار می‌رود که ابزاری رایج در پزشکی و تحقیقات زیست‌شناسی است. با استفاده از این روش می‌توان هزاران یا میلیون ها نسخه کپی از قسمت خاصی از DNA را از مقدار کمی DNA بدست آورد.

این تکنیک در سال ۱۹۸۳ توسط یک بیوشیمیست آمریکایی به نام Kary Mullis اختراع شد که در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را برای این اختراع خود دریافت کرد.

اساس کار PCR، شامل فرآیند گرم کردن و سرد کردن است که زنجیره های دمایی نامیده شده و توسط دستگاه مربوطه فراهم می‌شود. فرآیند PCR ممکن است چند ساعت به طول بیانجامد و یا با استفاده از دستگاه‌های خاص با سرعت بالا، در کمتر از یک ساعت انجام شود. این چرخه های دمایی ابتدا بصورت دستی کنترل می‌شدند و همچنین از آنزیم پلیمرازی استفاده می شد که نسبت به دما حساس بود و در هر چرخه دمایی denature می‌شد؛ در نتیجه لازم بود در هر چرخه، دوباره آنزیم پلیمراز به محیط  اضافه شود. Mullis در سال ۱۹۸۵ آنزیم Taq DNA polymerase را از باکتری حرارت دوست Thermus aquaticus استخراج و در آزمایش بکار برد تا در طول انجام PCR پایدار بوده و نیاز به اضافه کردن مجدد آنزیم در هر چرخه دمایی نباشد. همچنین در سال ۱۹۸۷ اولین ماشین PCR که PCR   1000 Thermal Cycler نام داشت توسط Cetus و Perkin-Elmer ساخته و به آزمایشگاه ها عرضه شد تا چرخه های دمایی را بطور اتوماتیک تکرار کند.

 مواد لازم PCR 

  1. DNA اولیه ای که قصد تکثیر آن را داریم.
  2. پرایمر ها (آغازگرها)
  3. نوکلئوتیدها؛ که به آن ها  dNTP گفته می‌شود و واحدهای ساختاری DNA هستند.
  4. آنزیم Taq polymerase (برای اضافه کردن نوکلئوتید ها به زنجیره DNA)
  5. بافر که برای ایجاد شرایط مناسب واکنش بکار می‌رود.

مراحل PCR 

۱.مرحله‌ی واسرشته شدن یا  denaturing phase 

مرحله ای که در آن، در نتیجه‌ی بالا رفتن دمای واکنش تا حدود ۹۴ درجه‌ی سانتیگراد، با شکستن پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازها،دو رشته DNA از هم جدا شده و از یک مولکول DNA، دو تک رشته DNA حاصل می‌شود که هر کدام از این رشته ها بعنوان رشته‌ی الگو برای ساخت DNA جدید عمل می‌کنند.این مرحله بین ۱۵ تا ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.

۲.مرحله‌ی اتصال یا annealing phase 

در این فازدما تا حدود ۵۰-۶۵ درجه (بسته به دمای اتصال پرایمرها) کاهش می‌یابد تا پرایمرها به ناحیه مکمل خود در DNA متصل می‌شوند. (یکی از پرایمرها به سر ‘۵ یک رشته‌ی DNA و دیگری به سر ‘۳ رشته‌ی دیگر متصل می‌شوند). مرحله‌ی اتصال حدود ۱۰ تا ۳۰ ثانیه طول می‌کشد.

۳.مرحله‌ی گسترش یا extension phase 

افزایش مجدد دما، تا حدود ۷۲ درجه سانتیگراد، سبب فراهم آمدن دمای مطلوب برای فعالیت آنزیم DNA polymerase  Taq شده و آنزیم می‌تواند در چنین شرایطی dNTP ها را به پرایمر اولیه اضافه کرده و به تدریج رشته‌ی جدید را طویل سازد. این آنزیم از باکتری گرمادوستی به نام  Thermus aquaticus گرفته شده که در دماهای بالا قادر به ادامه‌ی حیات است. بنا براین آنزیم در دمای بالایی که طی فاز denaturing با آن مواجه است تخریب نمی‌شود. مدت زمان این مرحله به طول DNA بستگی دارد ولی رونویسی هر هزار نوکلئوتید بطور متوسط حدود ۱ دقیقه زمان می برد.

این سه مرحله حدود ۲۰ تا ۴۰ بار در طول PCR تکرار می‌شوند و هربار مقدار DNA موجود، به دوبرابر افزایش می‌یابد.

پس از این که تکثیر انجام شد با استفاده از تکنیک الکتروفورز، کیفیت و اندازه‌ی DNA های ساخته شده قابل بررسی است.

 

اگر به این مبحث علاقه مندید، مقاله« Real time PCR و کاربردهای آن» را مطالعه بفرمایید.

 

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی

vistagene vistagene ویستاژن

سایت ویستاژن در این مقاله به پروسه تولید دارو و مراحل انجام آن پرداخته است.

صفر تا صد تولید دارو

داروسازی و تولید دارو یکی از جذاب ترین حوزه های علم بیوشیمی است. دارو ها منشا های مختلفی دارند و به سه دسته طبیعی، نیمه مصنوعی و مصنوعی تقسیم می شوند.

 داروهای طبیعی

 

دارو های طبیعی دو نوع هستند که نوع اول آن به صورت خام مورد استفاده قرار می گیرد مانند: الوئه ورا
و نوع دوم مواد شیمیایی هستند که به صورت خام استخراج شده و به عنوان دارو مورد استفاده قرار می گیرند مانند: مورفین که از تریاک استخراج می شود.
برای اطلاع در مورد داروهای طبیعی از طب سنتی استفاده می کنند و با استفاده از ان به خواص دارویی گیاهان و مزیت های جانوران پی می برند.
سپس بررسی هایی در داخل یا خارج بدن موجود زنده انجام می دهند و اگر آن فراورده موثر تشخیص داده شود، ترکیبات موجود در آن را خالص و تفکیک می کنند و با روش های دستگاهی مانند MS,UV,IR تلاش می کنند تا به ساختار شیمیایی ان ترکیب پی ببرند.
سپس آزمایشات نهایی برای اثبات اثر ماده انجام می گیرد و به عنوان دارو معرفی می شود.

 داروهای نیمه مصنوعی

برای برطرف کردن کاستی های دارو های طبیعی، تغییرات شیمیایی جزئی روی آن انجام می دهند و به کمک آن داروی نیمه مصنوعی تولید می شود.
برای رسیدن به این داروها باید عملیات های دقیقی روی داروی طبیعی انجام شود تا بدون تغییر در خواص مطلوب، ویژگی های مضر آن را حذف گردد.
مثلا: پنی سلین را که یک داروی طبیعی ست به صورت خوراکی نمی توان مصرف کرد اما با تغییراتی که در ان ایجاد می شود می توان آن را به صورت خوراکی استفاده نمود .

داروهای مصنوعی

با پیشرفت شیمی آلی، ترکیب های شیمیایی مختلفی ساخته شده اند که برخی از انها دارای اثرات درمانی هستند.به این گونه از مواد داروی مصنوعی می گوییم.
در اینگونه داروها محققان حدس می زنند که ممکن است کدام ماده شیمیایی روی کدام بیماری اثر بگذارد و ممکن است حدس آن ها درست باشد و یا اصلا آن ماده کارساز نباشد.
داروی AZT که تا حدودی بر روی ایدز موثر است و با این روش بدست آمده است.

مراحل بررسی ایمنی دارو

یک دارو همان گونه که خواص درمانی زیادی را داراست ممکن است خطرناک باشد به همین دلیل باید چهار مرحله را طی کند.

  • مرحله اول

این مرحله ممکن است سه سال یا بیشتر طول بکشد و برای اطمینان از سمی نبودن و بی خطر بودن طی می شود. در این مرحله دارو روی جانوران مختلف و جنین های جانوران تست می شود.
امروزه تلاش بر این است که از حیوانات آزمایشگاهی کمتر استفاده شود و به همین دلیل برای انجام ازمایش ها از نمونه سازی رایانه ای کمک می گیرند اما ازمایش روی حیوانات بسیار مفیدتر است.
اگر ماده دارویی اثر سمی نداشته باشد وارد مرحله بعد می شود.

  • مرحله دوم

در این مرحله دارو روی یک انسان سالم داوطلب ارزیابی می شود که به این کار فارماکوکینتیک می گوییم.
اگر نتایج مطلوب باشد وارد مرحله بعد می شود.

  • مرحله سوم

دارو را به تعداد کمی از بیماران می دهند که اثرات آن را روی انسان بیمار بررسی کنند و این مرحله ۳ تا ۵ سال طول می کشد.
در صورتی که نتایج مورد رضایت باشد،دارو مجوز ورود به بازار می گیرد و وارد مرحله چهارم می شود.

  • مرحله چهارم

این مرحله، مرحله پس از فروش است و اثرات دارو روی افراد سراسر دنیا با قومیت ها و ملیت های مختلف مورد بررسی قرار می گیرد.
متخصصان از سراسر جهان مضرات آن را به WHO گزارش می دهند و در صورت مضر بودن، دارو از سطح بازار جمع می گردد.
به همین علت سالانه دارو های زیادی جمع اوری و حذف می گردد.

 عوارض جانبی داروها

دارو ها با وجود گذشتن از پروتکل های بسیاری باز هم بدون ضرر نیستند.
بعضی از ان ها عوارض کم خطر و بعضی دیگر عوارض بسیار خطرناکی دارند.
عوارضی که خطرات کمتری دارند از ابتدا قابل پیش بینی بوده و اکثر دارو ها از این دسته هستند.
اما برخی دارو ها پس از استفاده گسترده عوارض خود را اشکار می کنند که خطرات بیشتری را به دنبال دارد.
دارویی که تولید می شود بدون عوارض نیست اما نکته مهم این است که باید خواص دارویی بسیار بیشتر از عوارض جانبی باشد تا دارو تایید شده و مورد استفاده قرار بگیرد.
همه این عملیات زیر نظر وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی، اداره کل نظارت بر امور دارو و مواد مخدر، اداره بررسی و ثبت، اداره نظارت فنی و اداره امور داروخانه ها انجام می گیرد.