وسترن بلات چیست؟

,

سایت ویستاژن

    وسترن بلات با استفاده از Anti-His

وسـتـرن بـلاتینـگ شامل جد‌اسازی مخلوط پروتئینی بر روی ژل و سپس انتقال آن‌ها به یک غشای مناسب است. سپس مولکول پــروتـئـیـن از طـریـق میان کنش بـا یـک آنـتــی‌بــادی اخـتـصــاصــی نشان‌دار، شـنــاســایـی می‌شود. ازآنجایی‌که غالباً وسترن بلاتینگ را به کمک اتصال آنتی‌بادی‌ها مورد تجزیه‌وتحلیل قرار می‌دهند، به آن ایمونو بلاتینگ نیز گفته می‌شود. کلمه‌ی بلاتینگ به روش انتقال اشاره دارد و کلمه‌ی ایمونو به خاطر لزوم استفاده از واکنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی اختصاصی در مرحله شناسایی می‌باشد. این تکنیک توسط Towbin و همکاران در سال ۱۹۷۹ ابداع گردیده است و ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین‌ها به یک‌فاز جامد است. با این روش می‌توان اطلاعاتی در مورد خصوصیات مختلف آنتی‌ژن‌های پروتئینی شامل وجود و مقدار آنتی‌ژن، وزن مولکولی پروتئین، ایزوفرم‌ها و محصولات شکسته شده آن و کارایی روش استخراج آنتی‌ژن به دست آورد. درعین‌حال وسترن بلات اطلاعاتی در مورد اینکه چه مقدار پروتئین در سلول وجود دارد در اختیار ما قرار می‌دهد. در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی از این تکنیک به‌منظور بررسی و تأیید حضور یک آنتی‌بادی در بدن و تشخیص بیماری‌های عفونی و انگلی، بیماری‌های خود ایمنی و آلرژی استفاده می‌شود. در وسترن بلاتینگ مولکول‌های جداشده توسط ژل الکتروفورز از ژل به پالایه‌های غشایی انتقال داده می‌شوند. این موکول‌ها در سطح غشا فیلتری در همان محلی که منتقل‌شده‌اند پایدار باقی می‌مانند. در این حال به سهـولـت برای انجام واکنش با آنتی‌بادی‌های اختصاصی آمادگی دارند. غشا مورداستفاده در روش وسترن بلاتینگ معمولاً نیترو سلولز و یا پلی وینیل دی فلوراید[1] است. انتقال پروتئین از ژل به غشا توسط الکتروفورز معکوس و در طول ۳۰ دقیقه تا ۲ سـاعـت صـورت مـی‌گیـرد. ایـن کـار تـوسط دو روش مرطوب[2] و نیمه‌خشک[3] صورت می‌گیرد. در روش مرطوب ژل الکتروفورز در یک قاب در کنار غشا و در ظرفی حاوی بافر بین دو الکترود قرار می‌گیرد. اعمال جریان الکتریکی و برقراری اختلاف‌پتانسیل موجب مهاجرت یون‌ها از ژل به غشا خواهد شد. در روش نیمه‌خشک ظرف بافر با فیلترهای کاغذی آغشته به بافر جایگزین می‌شود. بعـد از تثبیـت پروتئین‌ها بر روی غشا برای حصول اطمینان از کامل بودن انتقال مـی‌تـوان از روش‌هـای رنـگ‌آمیـزی غیراختصاصی استفاده کرد. درعین‌حال آنتی‌بادی‌های اختصاصی قادر به نشان دادن استانداردها ازجمله مارکرهای وزن مولکولی روی ژل نیستند. بنابراین در کنار تشخیص با آنتی‌بادی می‌توان برای آنالیز کامل از یک روش رنگ‌آمیزی مانند Ponceau S استفاده کرد.

 

در این پژوهش بعد از مشاهده باند پروتئین LIV-1، تأیید پروتئین با استفاده از وسترن بلات با آنتی‌بادی Anti-His صورت گرفت.

پس از اتمام ران کردن ژل، ژل را از مخزن خارج کرده و ژل متراکم کننده را می‌بریم. در این پژوهش، از غشای نیترو­سلولز استفاده شد.

  • غشای نیتروسلولز را به مدت ۵ دقیقه در متانول قرار می­دهیم.
  • سپس غشا، ژل و ۲ عدد پد را در بافر انتقال ( ۱۴٫۴ گرم گلایسین و ۳٫۰۳ گرم تریس را در حجم ۸۰۰ میلی‌لیتر dH2O حل می‌کنیم و سپس ۲۰۰ میلی‌لیتر متانول به آن اضافه می­کنیم) به مدت ۱۵ دقیقه قرار می­دهیم.
  • سپس ژل و غشای نیتروسلولز را به دستگاه semidry منتقل می‌کنیم. بدین ترتیب ابتدا روی دستگاه کمی بافر انتقال می­ریزیم و بعد پد را روی دستگاه قرار داده و سپس غشا را روی آن می­گذاریم و با رول مخصوص حباب‌ها را خارج می­کنیم. ژل را دقیقاً روی کاغذ قرار می­دهیم و در نهایت پد را روی ژل قرار می­دهیم. حباب‌های حاصل را خارج می­کنیم و به مدت ۵۰ دقیقه با ولتاژ ۲۰ ولت، جریان الکتریکی را برقرار می­کنیم.

۵-       بعد از اتمام انتقال باندهای پروتئین به غشا، غشا را در بافر blocking buffer(Skim milk 3%) به مدت یک شب در ۴ درجه سانتی‌گراد قرار می­دهیم.

۶-        روز بعد غشا را با بافر PBS 1X،۴ بار شستشو می­دهیم.

۷-       سپس آنتی­بادی، آنتی His با غلظت ۱ به ۲۰۰۰ اضافه گردید و به مدت ۱۶ ساعت در دمای اتاق شیک شد.

۸-        غشا ۴ بار با بافر PBS 1X، شستشو داده شد.

  • سپس آنتی­بادی αRb HRP با غلظت ۱ به ۱۰۰۰ اضافه گردید و در دمای اتاق به مدت ۶ ساعت بر روی شیکر ،شیک شد.
  • سپس با محلول رنگ­زا DAB   رنگ­آمیزی شد.

 

[1]-PolyvinylideneDifluoride) PVDF(

[2]– Wet

[3]-Semi dry

0 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

یک × 4 =