کلونینگ و پروتکل انجام آن

, ,

سایت ویساژن در این مقاله به توضیح روش کلونینگ پرداخته است. در صورت داشتن سوال پیرامون این روش، آن را در سایت ثبت نموده تا توسط کارشناسان ما پاسخ داده شود.

کلونینگ چیست؟

کلونینگ به تولید کپی های یکسان از ارگانیسم ها، سلول ها یا توالی های نوکلئویک اسید می گویند. این فرایند با دستکاری و تداخل انسان صورت می پذیرد.

نکته: توالی های  DNA انسانی که در طی رشد طبیعی تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب نمی شوند ولی توالی هایی که به وسیله ی  PCR  تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب می شوند.

 

کلونینگ

مراحل Gene cloning

1 – جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از بقیه قطعات DNA

2 – گزینش وکتور مناسب

3 – اینتگره و متصل کردن ژن با وکتور و ایجاد پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – منتقل کردن پلاسمید به میزبان  ( Transformation or Translection)

5 – تکثیر و زیاد کردن پلاسمید (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 – انجام رونویسی (Transcription  )

7 – ترجمه و ساخت  پروتئین (Translation )

خلاصه مراحل کار

برای کلون کردن محصول PCR که درون وکتور مناسب قرار گرفته است، به همراه وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر یکسان برش داده می شود و با یکدیگر مخلوط می گردند و توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل می شوند. در مرحله بعد این مولکول DNA نوترکیب طی روندی به نام ترانسفورماسیون به درون سلول میزبان انتقال می یابد.

جداسازی محصول PCR

در ژل آگارز قطعات DNA بر اساس وزن از هم جدا می شوند. در نتیجه باند محصول PCR از ژل جدا و خالص می شود.

مواد مورد استفاده

  • ایزوپروپانل
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer

روش کار جداسازی ژن

  • باند مورد نظر توسط اسکالپل از ژل جدا می شود. بهتر است تا حد ممکن کمترین میزان ژل به همراه باند جدا شود.
  • سپس 300 میکرو لیتر Binding Buffer  به آن اضافه می شود.
  • ژل آگارز به همراه بافر برای مدت 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار می گیرد تا ژل به خوبی حل شود.
  • 150 میکرولیتر ایزوپروپانول به آن اضافه می شود.
  • نمونه به خوبی ورتکس شده، کل نمونه به یک Filter tube که درون یک Collection tube  قرار دارد منتقل می شود. و در 13200 rpm  برای یک دقیقه سانتریوفیوژ می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 500 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 200 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • Filter tube درون یک تیوپ اپندروف استریل قرار گرفته و µl 50 محلول Elution   به آن اضافه می شود. پس از سانتریوفوژ نمونه در 13200 rpm  برای مدت 1 دقیقه  درون تیوپ انتقال می یابد.
  • برای ارزیابی کیفیت و غلظت DNA تخلیص شده 5 µl از نمونه در ژل آگارز 1 درصد ران می شود.

لایگیشن

  • لایگیشن مقدمه ای برای مرحله بعد یعنی ترانسفورماسیون می باشد جهت تکثیر قطعه هدف به مقدار زیاد، این قطعه باید در وکتور مناسب وارد شده و سپس همراه با وکتور وارد یک سلول میزبان شود.
  • آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین دو نوکلئوتید مجاور می شود. از نکات بسیار مهم در این واکنش غلظت نمونه DNA  هدف می باشد که برای موفقیت واکنش بسیار مهم است.

مواد مورد استفاده

  • پلاسمید  3 µl
  • DNA تخلیص شده 16 µl
  • Ligation buffer 3 µl
  • آنزیم 1 µl
  • PEG 3 µl
  • آب مقطر 1 µl

روش کار

  • در یک تیوپ اپندروف cc5 مواد زیر با یکدیگر مخلوط شده و سپس برای مدت یک شب در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

تهیه سلول مستعد جهت ترانسفورماسیون

  • جهت انجام ترانسفورماسیون سلول مستعد مورد نیاز است که پلاسمید نوترکیب به درون آن انتقال یابد.

مواد مورد استفاده

  • باکتری
  • محلول CaCl2
  • محلول CaCl2-MgCl2
  • DMSO
  • محیط کشت

روش کار

  • ابتدا باکتری را در محیط  کشت داده و در انکوباتور 37 ساعت انکوبه می شود.
  • یک کلونی از باکتری را در 100 میلی لیتر محیط مایع کشت داده و در شیکرانکوباتور انکوبه کرده و پس از رسیدن به فاز لگاریتمی رشد انکوباسیون متوقف گردید.
  • محیط کشت به لوله 50 میلی لیتری انتقال می یابد( این لوله قبلا درون یخ قرار گرفته) و برای مدت 10 دقیقه درون یخ قرار می گیرد.
  • سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجهء سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

محیط روی سلول ها خارج و به رسوب حاصل , 30 میلی لیتر محلول CaCl2-MgCl2 سرد استریل اضافه شد.

سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

به رسوب باکتری 2 میلی لیتر محلول صفر درجه CaCl2 اضافه شد و سوسپانسیون سلولی تهیه شد.

به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد و به آرامی مخلوط گشت. و سپس به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد.

مجددا به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه و سلول ها تقسیم و در 70- درجهء سانتیگراد نگهداری شد.

ترانسفورماسیون

  • با استفاده از روش شوک حرارتی در لحظات کوتاهی منافذی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان ایجاد کرده تا DNA نوترکیب وارد سلول شود. DNA حاصل از مرحله لایگیشن  جهت ترانسفورماسیون در سلول های مستعد مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین 100 µg/ml
  • IPTG
  • X-Gal
  • محصول لایگیشن ( پلاسمید نوترکیب)
  • سلول مستعد

روش کار

  • سلول های مستعد از دمای 70- درجه سانتیگراد خارج و در مجاورت یخ قرار داده می شوند تا به آرامی ذوب شوند.
  • تیوپ های اپندروف قبل از استفاده در یخ قرار می گیرند و سپس 20 میکرولیتر از سلول های مستعد به آنها اضافه شد.
  • 1 میکرولیتر از محصول لایگیشن به آرامی با سلول ها مخلوط و به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شد.
  • تیوپ های اپندروف حاوی سلول و پلاسمید جهت شوک حرارتی , به مدت 30 ثانیه در دمای 42 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • تیوپ های اپندروف برای مدت 2 دقیقه در یخ قرار داده شد.
  • 80 میکرولیتر محیط کشت مایع بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
  • سپس این باکتری ها روی پلیت های حاوی آمپی سیلن( 100, X-Gal و IPTG کشت داده شد و در دمای 37 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • در ترانسفورماسیون سلول ها , استفاده از کنترل جهت ارزیابی کارایی ترانسفورماسیون و سلول ها و ممانعت از آلودگی , ضروری است

غربالگری

  • برای غربال نمودن کلنی های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده از آنتی بیوتیکی که ژن مقاومت به آن توسط وکتور نوترکیب حمل می گردد استفاده می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین
  • IPTG
  • X-Gal
  • پلیت های حاوی باکتری ترانسفورم شده

روش کار

  • ابتدا پلیت حاوی محیط کشت را به مدت 20 دقیقه زیر هود قرار داده تا به دمای محیط برسد. ( به این محیط کشت قبلا آمپی سیلین اضافه شده است) .
  • 40 میکرولیتر IPTG و 40 میکرولیتر X-Gal به سطح محیط کشت اضافه کرده و با غلطک شیشه ای پخش می شود و کمی فرصت داده می شود تا این مواد جذب محیط کشت شود.
  • با یک لوپ استریل از کلنی های سفید که به صورت تک می باشد برداشته و روی پلیت جدید کشت داده می شود. این کار برای اطمینان یافتن از صحت ترانسفورماسیون در کلنی های مورد نظر می باشد.
  • سپس پلیت ها به مدت یک شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند.
  • IPTG شناسایی پروموتور ویژه ژن Lac Z در فرادست ناحیه 5´ ژن و القاء رونویسی آن و تولید آنزیم بتا گالاکتوزیداز را بر عهده دارد. سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و آنزیم بتا گالاکتوزیداز را تولید کنند حاوی وکتور نرمال می باشند. اما سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و به دلیل وارد شدن قطعه DNA هدف این ژن قادر نباشند آنزیم فوق را تولید کنند حاوی وکتور نوترکیب می باشند.
  • X-GaL به عنوان سوبسترا برای بتا گالاکتوزیداز محسوب شده و بعد از تجزیه توسط این آنزیم ماده ای به رنگ آبی تیره در اطراف سلول های حاوی ژن فعال بر جای می ماند.وکتور نوترکیب به دلیل عدم آنزیم فوق نمی تواند X-Gal را تجزیه نماید در نتیجه کلنی های تشکیل شده سفید می باشند.

استخراج پلاسمید

روش لیز قلیایی به همراه دترجنت SDS بیش از 20 سال است که برای جداسازی پلاسمید از باکتری E.Coli  مورد استفاده قرار می گیرد. اگر سوسپانسیون باکتریایی با دترجنت های غیر یونی قوی در  pH بالا مجاور شود. دیواره باکتری تخریب کروموزوم و پروتئین های باکتریایی دناتوره و پلاسمید در محیط آزاد می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط LB Broth حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین
  • Suspension Buffer
  • RNase A
  • Lysis Buffer
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer
  • High pure filter tubes
  • Collection tube

روش کار

  • باکتری در محیط حاوی آمپی سیلین کشت داده می شود تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر به 5/1 تا 5 برسد.
  • 4-5/0 میلی لیتر از محیط سانتریوفوژ می شود تا سلول ها جدا شوند.
  • سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از محلول susprnsion buffer RNase تهیه می شود.
  • 250 میکرولیتر Lysis Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.
  • 350 میکرولیتر Binding Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در روی یخ انکوبه می شود
  • نمونه به مدت 10 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • محلول رویی به درون یک فیلتر تیوپ منتقل شده و 30 ثانیه تا 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • فیلتر توسط 700 میکرولیتر Wash Buffer شسته و فیلتر تیوپ به مدت 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • مایع تجمع یافته خارج شده , و 50 میکرولیتر Elution Buffer  یا   آب به آن اضافه می شود.
  • نمونه به مدت 1 دقیقه در 13200 rpm ساتریوفوژ شده و محصول انتهایی DNA پلاسمیدی تخلیص شده می باشد.

 

vistagene   vistagene   vistsgene   vistagene  vistagene   ویستاژن ویستاژن ویستا ژن  ویستا ژن  ویستا ژن

استفاده از مطالب سایت ویستاژن تنها با ذکر نام و لینک سایت و با هماهنگی با مدیریت  امکان پذیر می باشد.

6 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

20 − 1 =