سایت ویستاژن در این مقاله به معرفی اصول اولیه در میکروبیولوژی و همچنین توضیح انواع محیط کشت و نحوه ساخت آنها پرداخته است.
میکروبیولوژِی چیست ؟
میکروبیولوژی شاخه ای از علم زیست شناسی است که دربارهٔ شکل ظاهری،ترکیب، ویژگی‌ها و بیماری‌زایی میکروارگانیسم‌ها یا جانداران بسیار ریز تحقیق می‌کند. علم میکروبیولوژی به بررسی باکتری‌ها، ویروس‌ها و یوکاریوت‌هایی مانند قارچ و تک سلولی‌ها یا پروتوزوئرها می پردازد.
میکروب موجودی تک سلولی و مستقل است. به منظور مطالعه ی میکروب ها احتیاج داریم تا آن ها را در محیط های کشتی که از لحاظ فیزیکی و شیمیایی مناسب هستند رشد دهیم. در ابتدا باید بدانیم منظور از محیط کشت چیست؟ محیط کشت مناسب به محیطی اطلاق می شود که نیاز های میکروب برای رشد و تکثیر را فراهم می کنند. مثال این نیاز ها غذا، آب، مواد آلی، مواد معدنی، حرارت، رطوبت کافی، نمک، pH مناسب، حضور یا عدم حضور اکسیژن و … است. این محیط ها بطور کلی 2 دسته هستند
1. ساخته دست بشر (اکثرا بصورت پودری هستند و پس از حل کردن در مقادیر معینی از آب مقطر و پس از استریل کردن بدست می آیند)
2. طبیعی (داخل سلول های بدن جانداران)
خون را می توان به عنوان یک محیط کشت طبیعی مناسب نام برد زیرا تمام نیاز های باکتری اعم از درجه حرارت لازم، pH مناسب، اکسیژن،مواد مغذی و … را دارد. آگار نوعی ماده کلوئیدی است که از دیواره سلولی جلبک قرمز دریایی بنام ژلدیوم بدست می آید و حالت ژله ای ایجاد می کند. آگار می تواند حرارت 37 درجه سانتی گراد را که برای رشد تمام میکروب های بیماری زای انسانی مطلوب است،تحمل کند و هیچ میکروبی آن را ذوب و هضم نمی کند. جنس آگار پلی ساکاریدی است و نقطه ذوبی حدود 95 درجه سانتی گراد دارد. محیط های کشت را براساس تفاوت میزان آگار در آن ها به 3 دسته تقسیم می کنند
1.جامد(آگار)
2.نیمه جامد
3.مایع(براث)
واضح است که در محیط های جامد میزان زیادی آگار وجود دارد و در غیر جامد کمتر و در محیط کشت مایع آگار وجود ندارد. محیط های کشت مایع را در لوله و محیط های کشت مایع و جامد را پیلیت ایجاد می کنند. محیط های کشت درون پلیت اغلب محیط های کشت عمومی هستند که گاهی با اضافه کردن مواد مغذی پس از اتوکلاو شدن، می توان موجب افزایش سریع رشد ارگانیسمهای سخت شد. این مواد مغذی عبارتند از شیر بی چربی، خون گوسفند، زرده تخم مرغ و… .
در محیط های کشت جامد،غیر جامد و مایع برای وارد کردن باکتری و کشت باکتری مورد نظر از لوپ های متفاوتی استفاده می کنیم. لوپ حلقوی و لوپ سوزنی.
مثال هایی از محیط های کشت جامد، غیرجامد و مایع بصورت زیر است
- اوره که مایع و زرد رنگ بوده و برای کشت باکتری در آن از لوپ حلقوی استفاده می کنیم.
- محیط MR-VP یا متیل رد که صورتی رنگ و مایع بوده و باز هم از لوپ حلقوی استفاده می کنیم.
- محیط های سیترات (سبز رنگ) و TSI (قرمز) محیط های جامد هستند و اصطلاحا به آن ها محیط های اسنت گفته می شود یعنی در لوله بصورت مایل قرار می گیرند تا کج کشت داده شوند.
اما در محیط TSI از لوپ سوزنی استفاده می کنیم و در محیط سیترات از لوپ حلقوی استفاده می کنیم. محیط کشت TSI نیز تریپل شوگر آیرون آگار نام دارد که سرشار از گلوکز و لاکتوز است.
مثالی برای محیط نیمه جامد می توان به SIM اشاره کرد که زرد رنگ بوده و برای کشت باکتری در این محیط می بایست از لوپ سوزنی استفاده کرد. نام دیگر SIM سولفید اندول موتیلن است و می تواند به خوبی حرکت باکتری را نشان دهد.
محیط های کشت بر اساس نوع کاربرد محیط کشت به 4 دسته تقسیم می شوند
- محیط های کشت انتخابی
- محیط های کشت افتراقی
- محیط های غنی کننده
- محیط های کشت کامل
محیط های کشت انتخابی
ممکن است بخواهیم گروهی از میکروب ها را رشد دهیم و جدا کنیم و عاملی در برخی مواد غذایی وجود دارند که باعث جلوگیری از ارگانیسم های مطلوب شده و باعث تشدید رشد میکروب مورد نظر شوند. در این شرایط ما از این ماده مغذی کمک میگیریم و به محیط کشت خود اضافه می کنیم. که به محیط کشت ما محیط کشت انتخابی اطلاق می گردد.
محیط کشت افتراقی
این محیط کشت بصورت تشخیصی بوده و انواع مختلفی از کلنی ها را از همدیگرمی تواند تشخیص دهد. از این محیط برای رشد باکتری های گرم منفی روده ای استفاده می کنند چون حضور املاح صفراوی مانع رشد باکتری های گرم مثبت در محیط می شوند.
محیط های غنی کننده
در مواردی که تعداد میکروب های مورد نظر در نمونه غذایی کم باشد و یا به علت وجود زیاد میکروب های دیگر،جدا کردن میکروب مورد نظر سخت است،این محیط کاربرد دارد.
محیط کشت کامل
در این محیط شرایط و مواد لازم برای رشد کلیه باکتری هاست و حدود 80% از آن ها در این محیط ها رشد می کنند و مواد ضدمیکروبی ندارند.با رشد باکتری ها در آن تغییر رنگ مشاهده می کنیم.
نحوه ی تهیه محیط کشت (آگار)
1- حجم پودر بر اساس تناسب استفاده می شود . ( از روی جعبه می خوانیم )
2- ترازو را صفر کرده ،پودر را ریخته و عدد خوانده می شود.
3- آب مقطر را اضافه می گردد ( یک سوم آبریخته می شود ، مخلوط که شد بقیه اضافه می گردد؛ تا به شیشه ارلن چیزی نچسد).
4- طبق دستور درج شده روی جعبه، اتوکلاو می گردد. (فشار 105 اتمسفر و حرارت 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه ) این حرارت مرطوب برای استریل است . روی ارلن با فویل می بسته می شود تا خروجی مسدود گردد سپس در منفذ را می بندیم و تا قبل از سرد شدن در اتوکلاو را باز نمی کنیم .
5- هر پلیت به اندازه دوسوم پر از مایع می گردد.
6- حرارت 40 درجه را روی هر پلیت گرفته تا ژله ای شود.
7- به مدت ۲۴ ساعت بصورت وارونه در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا کاملا جامد شود.
کشت باکتری در محیط کشت مایع
- لوپ را برمیداریم و در بالاترین نقطه قسمت شعله میگیریم تا به رنگ سرخ در آید. سپس لوپ را از شعله خارج می کنیم و در کنار شعله نگه می داریم تا خنک شود.
- پلیت حاوی میکروب را کنار شعله می آوریم و در کنار شعله درب آن را باز می کنیم.
- اگر محیط کشت ما در لوله باشد،دهانه لوله مورد نظر را چندبار از روی شعله عبوذ می دهیم.
- نوک لوپ را در گوشه ای از پلیت حاوی میکروب فرو می بریم تا کاملا سرد شود و سپس با فشار بسیار کمی بصورت رفت و برگشتی از روی سطح پلیت مورد نظر مقداری میکروارگانیسم مورد نظرمان را بر میداریم.
- پلیت را کنار شعله میگیریم و دربش را می بندیم.
- محیط کشت مورد نظر را در دست چپ میگیریم و نوک لوپ حامل میکروب را در آن فرو می بریم و با تکان دادن لوپ سعی می کنیم تا میکروب را درون محیط کشت حل کنیم.
- درب لوله حاوی محیط کشت و باکتری را دوباره با شعله استریل می کنیم و در آن را می بندیم و در داخل انکوباتور می گذاریم.
- نوک لوپ را استریل می کنیم.
کشت باکتری در محیط کشت جامد
محیط های کشت جامد به 2 صورت جامد در لوله و جامد در پلیت هستند. محیط کشت جامد در لوله خود به 2 نوع عمودی و شیبدار تقسیم می شوند و روش های خاص خود را دارند.
محیط کشت جامد در لوله بصورت عمودی
محیط کشت آگاردار را در شرایط استریل و بصورت مذاب درون لوله آزمایش استریل می ریزیم و بصورت عمودی قرار می دهیم تا سرد شود.
برای کشت میکروبی در این مدل از یک لوپ نوک تیز استفاده می کنیم و پس از برداشتن میکروارگانیسم (پرگنه)بوسیله ی نوک لوپ آن را بصورت عمودی و عمقی در مرکز محیط کشت فرو میبریم و لوپ را بدون تکان دادن از همان مسیر فرورفته در محیط کشت خارج می کنیم.سپس لوله را درون انکوباتور قرار می دهیم.واضح است در نقاط ابتدایی تماس لوپ با محیط کشت (سطح محیط کشت و قسمت کم عمق) تراکم باکتری قابل مشاهده است و در قسمت های عمیق تر و انتهایی تر از این تراکم کاسته می شود. قسمت های انتهایی برعکس قسمت های سطحی اکسیژن کمتری دارند و میکروارپانیسم های هوازی و بی هوازی بر اساس نیاز خود در محیط رشد می یابند.
محیط کشت جامد در لوله بصورت شیبدار
در این حالت پس از ریختن محیط کشت در لوله آن را به صورت شیبدار قرار می دهیم تا سرد شود.همانند روش قبل بوسیله لوپ باکتری را برداشته و در کنار شعله ابتدا لوپ را بصورت عمودی در قسمت عمودی محیط کشت فرو می بریم و به آرامی از همان مسیر خارج کرده و بدون جدا شدن نوک لوپ از محیط آن را بصورت زیکزاگ روی سطح شیبدار می کشیم. در این روش می توانیم ببینیم باکتری ها هم در قسمت عمودی (داخل محیط) و هم در قسمت شیبدار رشد کرده اند و منجر به تغییر رنگ محیط شده اند که بیانگر اختیاری بودن هوازی یا بی هوازی بودن آن هاست یا فقط روی سطح شیبدار رشد کرده اند که نشان دهنده هوازی بودن باکتری است.
کشت باکتری در پلیت به 3 صورت است
- خطی
- سطحی
- پورپلیت یا آمیخته
کشت باکتری بصورت خطی
کشت خطی 4 مر حله ای است و هدف آن جداسازی و ایزوله و کردن باکتری و رسیدن به کلنی های منفرد (خالص سازی ) است.
در این روش محیط کشت را به 4 منطقه ی A و B و C و D تقسیم می کنیم. آنس استریل شده را به باکتری آغشته می کنیم و از منطقه ی A شروع به کشیدن خطوطی تا وسط پلیت می کنیم . آنس را استریل می کنیم . سپس دوباره آنس را وارد مرحله ی B می کنیم (پلیت را 90 درجه می چرخانیم ) اوایل کار از منطقه ی A وارد B می کنیم . (حدودا 3 خط ) ولی بقیه را بدون ورود به A تا وسط محیط کشت می کشیم . دوباره آنس را استریل می کنیم پلیت را 90 درجه می چرخانیم و عین همان اعمال را از B به C انجام می دهیم . پس از تکمیل C آنس را استریل نمی کنیم و منطقه D را بدون اتصال به A B C می کشیم.به لحاظ تراکم باکتری ها در مناطق، حالت زیر رخ می دهد:
تراکم : A>B>C>D تراکم در D کمترین است و کلنی خالص است .
این کلنی ها شکل و اندازه ی مختلفی دارند . (نقطه ای _ گرد _ رشته ای _ صاف ) و همچنین رنگ های مختلفی نیز دارند .(سفید _ کرم _ صورتی).
علت این که در D دیگر آنس استریل نمی شود این است که نیاز به تراکم نداریم و به اخرین تراکم می خواهیم برسیم . منطقه ی D به هیچ عنوان با A B C اتصال ندارد .
علت استریل کردن مداوم آنس جلو گیری از شیوع باکتری های نا خواسته ی هوا و محیط اطراف .
کشت باکتری بصورت سطحی
در محیط های مایع میکروبی و یا محیط مایعی مانند شیرمشکوک به آلودگی میکروبی از این روش کشت استفاده می کنیم. به این روش کشت میکروبی داده ومیکروارگانیسم های موجود در آن را مشخص می کنیم.
برای این کار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه می کنیم. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا نوک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانیم کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنیم باید توجه داشته باشیم که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یکگرمخانه با دمای 50-25 درجه قرارداده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهیم تا قطرات رطوبت حذف گردد.همچنین می توانیم پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائیم. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.
کشت باکتری بصورت آمیخته یا پورپلیت
در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد. یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آن را در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده به میزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آن را کاملا مخلوط کنیم. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیط کشت بپوشانیم دراین حالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.
گردآورنده: سرکار خانم زینب خوشنود
محیط کشت ویستا ژن ویستا ژن ویستا ژن ویستا ژن ویستاژن vistsgene vistagene vistagene
