سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح روش کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC پرداخته است.

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC

(High Performance Liquid chromatography) این روش از کروماتوگرافی مهم ترین و‌ متداول ترین روش می باشد که برای مواد غیر فرار در زمینه های مختلف در علوم مورد استفاده قرار می گیرد.که برای جداسازی و شناسایی و اندازه گیری مقادیر کم از مواد استفاده می گردد.
اولین بار توسط دانشمندی به نام تسوت (گیاه شناس روسی )که بر روی جداسازی رنگدانه های برگ سبز تحقیق می نمود،شناخته شد.
به نتایجی که از دستگاه HPLC بدست آورده می شود، کروماتوگرام می گویند.

اصطلاحات رایج  که در روش کروماتوگرافی مایع استفاده می شود

فازمتحرک (mobile phase): مواد مایع یا گازی که در دستگاه درجریان می باشد و سبب حرکت و‌ جابجایی نمونه درطول ستون می باشد.

فازساکن (stationary phase)

مواد جامد یا مایعی که در کروماتوگرافی است که باعث مواد روی آن عمل جداسازی و یا اکثرا جذب را انجام دهد.

زمان بازداری (Retention time)

مدت زمانی که نمونه خود را به آشکار ساز می رساند.

نمونه (sample)

 مخلوطی می باشد که معمولا مایع است که برای بررسی و آنالیز و اندازه گیری به دستگاه وارد می شود.

اساس جداسازی در روش های کروماتوگرافی به این صورت است که نمونه یا محلولی علاقه بیشتری به فاز ساکن دارد زیرا با سرعت کمتری درطول ستون میتواند عبور کند یا نمونه ای تمایل شدیدتری دارد که در فاز متحرک باشد زیرا با سرعت بیشتری ازستون گذر میکند.

اجزای کلی دستگاه HPLC عبارتنداز

 

۱.پمپ

از اصلی ترین قسمت های دستگاه HPLC می باشد که پمپ ها دارای انواع مختلفی می باشد که در HPLC بیشتر از نوع پیستونی مورد استفاده قرار می شود. دو مورد از مهم ترین ویژگی های پمپ ها از یکنواخت بودن و بدون پالس بودن آنها را نام برد.
ممکن است در ستون دستگاه افت فشار ظاهر شود به همین دلیل کم بودن قطر ذرات می تواند نشاندهنده از این امر باشد. پس می توان نتیجه گرفت که از این جهت پمپ استفاده می شود که نمونه بافشار(حدود ۴۰۰مگا پاسکال) وارد سیستم شود.
یک نکته مهم درمورد پمپ ها میتوان اشاره کرد که ازقطعات ضدخوردگی استفاده می شود زیرا که باعث تزریق مایعات و حلال های خورنده به سیستم می شود.

Degasser.۲

یا گاززدا: قبل ازورود حلال به سیستم باید مطئن شد که هیچ گونه هوا یا گازهای دیگری وجود نداشته باشد که باعث به وجود آمدن پیک های اضافی و برهم زدن یا تداخل با پیک هایِ به وجود آمده ازنمونه می شود.
و به زبان ساده تر می توان گفت: گاززدا وظیفه حذف هوا و‌یا گازهای اضافی را انجام می دهد و از‌وارد شدن آنها به دستگاه جلوگیری به عمل می آورند.

۳.سیستم تزریق

به دلیل وجود پمپ ها، فشار در سیستم بالا می باشد و امکان تزریق مستقیم به سیستم وجود ندارد.
سیستم تزریق شامل:یک لوپ(حلقه نمونه بردار) و بارگیری(Load) و تزریق است. درموقع تزریق،انژکتور برروی لود قرار گرفته و هنگامی که برروی تزریق گذاشته میشود تا نمونه تزریقب به سمت ستون سوق پیدا کند.
میزان تزریق در HPLC باید کمتراز کروماتوگرافی گازی(GC) باشد که حدودا ۵تا ۵۰۰ ماکرو لیتر می باشد.

۴.ستون

از مهم ترین بخش های سیستم HPLC است به دلیل اینکه جداسازی نمونه درمواقع عبور در داخل ستون انجام میپذیرد.

۵.آشکار ساز

وقتی می خواهیم یک آشکارساز مناسب انتخاب کنیم باید منجر به بهترشدن انتخاب پذیری و حساسیت فاز ساکن شود.
آشکارسازها انواع مختلفی دارد و بسته به شرایطشون در کروماتوگرافی مایع HPLC مورد استفاده قرار می گیرند که شامل

آشکار ساز یا دکتور طیف سنجی جرمی

براساس وزن مولکولی می باشد و اغلب برای ترکیبات پایدار حرارتی قطبی که وزن مولکولی بالا دارد مورد استفاده قرار می گیرد.

آشکار ساز هدایت الکتریکی

این آشکارساز یا دکتور درکروماتوگرافی یونی کاربرد دارد.و‌برای محلول های حاوی مواد یونی یا محلول های یونی استفاده می شود.

آشکار ساز چرخش نوری

این دکتور برای اندازه گیری یا مقیاس ترکیباتی که دارای ایزومر نوری هستند کاربرد دارد و توانایی جداسازی ایزومرهای نوری R و L را انجام میدهند.

آشکارساز رزونانس مغناطیس هسته

این روش حساسیت پایینی دارد به همین دلیل مزیت های فراوانی رادر خود جای داده است که متصل شدن روش های جداسازی کروماتوگرافی با NMR باعث شده که روشی قدرتمند و سریع برای جداسازی و درست کردن ساختار ترکیبات مجهول و محلول ها باشد.

گردآورنده: سرکار خانم پریناز زارع

سایت ویستاژن در این مطلب به توضیح روش FPLC پرداخته است.

کروماتوگرافی یا سَوانِگاری چیست؟

کروماتوگرافی تکنیکی ساده است برای جداسازی و خالص سازی ترکیبات مختلف مورد استفاده قرار می گیرد.کروماتوگرافی براصل پخش فاز بنیان نهاده شده است.بطورکلی میتوان بیان‌داشت که کروماتوگرافی دارای دوفاز ساکن و متحرک است. و براساس فازمتحرک نامگذاری می شود،میتوان گفت هنگامی که‌ فاز ثابت بخش دو یا چند جز دراین دوفاز متفاوت باشد.
اجزای مربوطه قابلیت در فاز متحرک را دارا می باشند،هرچه فاز ساکن،یک‌جز محکمتر نگه دارد.درصد مولکول های جزئی بی حرکت نگه داشته شده بیشتر می شود، بنابراین بطور متوسط مولکول های جزئی که باشدت کمتر نگه داشته می شوند،نسبت به مولکول های دیگر با سرعت بیشتری ازروی فاز ساکن عبور می کنند،همانطور که قبلاً گفته شد: کروماتوگرافی دارای۲ فازساکن و متحرک می باشد که براساس فازمتحرک به دودسته تقسیم بندی میشود که عبارتند از

۱.کروماتوگرافی مایع

کاربرد این نوع کروماتوگرافی بیشتر دربخش های آموزشی، پژوهشی و درصنایع داروسازی و غذایی می باشد.

۲.کروماتوگرافی گازی

این کروماتوگرافی بیشتر در صنعت و بخش پژوهشی مورد استفاده می باشد.

برحسب کاربرد، چهار نوع کروماتوگرافی درآزمایشگاه مورد استفاده قرار می گیرد

۱.کروماتوگرافی مایع_گاز

این دسته جزکروماتوگرافی گازی میباشد و اساس روش آن GLC است که کاربرد وسیعی دارد و بین فاز متحرک گازی و‌یک فاز مایع ثبت میشود که برروی یک سطح ماده جامد بی اثرمی باشد.

۲.کروماتوگرافی ستونی

فرآیندی بسیار آرام می باشد که به مقدار بسیارزیادی ازنمونه یا محلول لازم است و بین فازهای مایع و جامد انجام می پذیرد.

۳.کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

این روش کروماتوگرافی بسیارآسان است و به سرعت انجام می شود و‌برای تفکیک اجزا یک مخلوط بسیار مفید است‌.این نوع کروماتوگرافی نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد-مایع است و اصول و اساس آن مانند کروماتوگرافی ستونی می باشد ولی دراین مورد جسم جامد بصورت یک لایه نازک برروی یک قطعه شیشه یا یک تکه پلاستیک مقاوم پخش میشود.یک قطره ازمحلول نمونه یا مجهول را درنزدیکی لبه صفحه گذاشته می شود و صفحه راهمراه میزان کافی ازحلال استخراج کننده درظرفی قرار داده می شود.
میزان حلال باید بصورتی باشد که فقط درسطح زیر لکه قرار بگیرد.حلال باید به سمت بالای صفحه رفته و اجزا مخلوط رابا سرعتهای متفاوت همراه خود می کند. درواقع ممکن است؛ بسیاری از لکه ها روی صفحه پدیدار می شوند. و یکی از مزیت های این روش احتیاج به میزان بسیارکمی از محلول مورداستفاده قرارمی گیرد.

۴.کروماتوگرافی کاغذی

این نوع کروماتوگرافی برروی یک کاغذ ممکن است ۲ساعت زمان ببرد. این نوع کروماتوگرافی درزیرمجموعه کروماتوگرافی مایع می باشد،زیرا دراین روش فازمتحرک حلالی می باشد که درشرایط مایع است.ساختار این نوع کاغذ از فیبرهای سلولزی می باشد.که عموماً بطور غیرمنظم درکنار یکدیگرند و باعث اختلال درکاغذ میشود.این امر خاصیت موئینگی رابر روی کاغذ افزایش می یابد که باعث میشود حلال های قطبی بویژه آب و الکل به راحتی برروی سطح کاغذ نفوذ می یابد.

:RF
مشخصه ای می باشد که میتوان به نسبت مسافت طی شده توسط نمونه به نسبت طی شده توسط حلال می باشد، که تشخیصی بربیان نوع ماده است.
Rf=b/a=
مسافت طی شده توسط نمونه/ مسافت طی شده توسط حلال.

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC

کروماتوگرافی مایع FPLC

(Fast Protein Liquid chromatography) یا کروماتوگرافی مایع سریع پروتئین که زیرمجموعه کروماتوگرافی مایع می باشد و درموارد آنالیز و یا خالص سازی مخلوط پروتئین ها مورد استفاده قرار می گیرد.این روش قادر است نمونه هایی با ابعاد چند میلی گرم (باستون هایی با حجم ۵لیتریا کمتر) تا نمونه های صنعتی باابعاد کیلوگرمی (باستون هایی باحجم چندین لیتر) رابه آسانی تجزیه و تحلیل می کنند. روش FPLC علاوه بر پروتئین ها برای تخلیص سایر مولکول های زیستی مانند لیپوپروتئین ها RNA و DNA مورد استفاده قرار می گیرد.این دستگاه مانند دیگر سیستم های کروماتوگرافی، جداسازی را برطبق برهم کنش متفاوت اجزای محلول با دوفاز ساکن و متحرک انجام می دهد. در FPLC فاز متحرک یک محلول آبی یا(بافر) می باشد. شدت جریان بافر با استفاده از یک پمپ کنترل بطور معمول ثابت نگه داشته میشود، درحالی که ترکیب بافر میتواند با ترکیب مایعات در روشFPLC ، جداسازی پروتئین را درزمان بسیارکوتاه تری نسبت به سایر روش ها انجام داد که بحث زمان دراین روش مهم ترین عامل و پراهمین است زیرا درصنعت برای تخلیص پروتئین در مقیاسی بزرگتر کاربرد دارد و به شکل بسیار وسیعی استفاده می شود.
ویژگی دیگری که این روش داراست واین روش را دارای تمایز کرده است فازساکن آن است که از دانه های باقطر کم تشکیل شده و درون یک ستون استوانه شیشه ای یا پلاستیکی با حجم بالا قرار دارد.دردستگاه FPLC طیف وسیعی از بافرهای آبی(متحرک) و فازهای ساکن بکاربرده می شود.

 

گردآورنده: سرکار خانم پریناز زارع

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش کروماتوگرافی پرداخته است.

کروماتوگرافی چیست؟

کروماتوگرافی تکنیکی است که در آزمایشگاه جهت تفکیک اجزای یک ترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ترکیب در یک فاز مایع حل می‌شود که توسط فاز دیگری به نام فاز ثابت نگه داشته می‌شود.اجزای مختلف مخلوط با سرعت‌های متفاوت حرکت می‌کنند و این عمل موجب جدا شدن آن‌ها از یکدیگر می‌شود.اساس این تفکیک بر جذب و توزیع مواد بین فاز متحرک و فاز ساکن استوار است.فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع و فاز متحرک می‌تواند مایع یا گاز باشد.

 تاریخچه کروماتوگرافی

کروماتوگرافی برای اولین بار در سال ۱۹۰۳ توسط دانشمندی روسی به نام میخائیل تسوت (Mikhail Tswett) به کار گرفته شد.این دانشمند در دهه‌ی اول قرن بیستم،بر روی جداسازی رنگدانه‌های گیاهی از قبیل کلروفیل،کاروتن و گزانتوفیل کار می‌کرد.به دلیل این که این ترکیبات دارای رنگ‌های مختلف هستند،این تکنیک “کروماتوگرافی” نام گرفت.انواع جدیدتر کروماتوگرافی که  بین دهه های ۱۹۳۰ و ۱۹۴۰ اختراع شدند،امکان استفاده از این روش را جهت جداسازی سایر ترکیبات نیز،فراهم کردند.

طی دهه‌های ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰، کروماتوگرافی در نتیجه‌ی کار مارتین (Archer john Porter Martin) وسینج (Richard Laurence Millington Synge) بطور چشمگیری توسعه یافت.آن‌ها اصول و تکنیک‌های پایه‌ای کروماتوگرافی پروتئین را بنیان نهادند و تلاش آنان سبب توسعه‌ی سریع چندین روش کروماتوگرافی شد:کروماتوگرافی کاغذی،کروماتوگرافی گازی و روشی که کروماتوگرافی گاز-مایع(HOLC) نام گرفت. از آن زمان ، این فناوری به سرعت پیشرفت کرده است.محققان دریافتند که اصول اصلی کروماتوگرافی تسوت می تواند به روش های مختلفی اعمال شود و در نتیجه انواع مختلف کروماتوگرافی اختراع و بکار گرفته شد.  پیشرفت‌های مداوم، باعث بهبود عملکرد فنی کروماتوگرافی شدند.

انواع کروماتوگرافی

بر اساس حالت فیزیکی فاز ساکن و فاز متحرک،کروماتوگرافی به انواع زیر تقسیم می‌شود:

  • کروماتوگرافی جامد-مایع

   ژلی

  تبادل یونی

   کاغذی

   لایه نازک

  • کروماتوگرافی جامد-گاز

  • کروماتوگرافی مایع-مایع

   کاغذی

   تقسیمی

  • کروماتوگرافی مایع-گاز

همچنین می‌توان کروماتوگرافی را از لحاظ شکل بستر به انواع زیر تقسیم کرد:
  • ستونی

کروماتوگرافی ستونی روشی از جداسازیست که فاز ساکن داخل یک لوله قرار دارد.فاز ساکن جامد،با یک مایع پوشیده شده است که ممکن است همه‌ی فضای لوله را اشغال کند یا در امتداد دیواره‌ی درونی لوله متمرکز شود و فضایی در قسمت میانی لوله برای عبور فاز متحرک ایجاد شود.پس از جریان یافتن حلال در داخل ستون،فاز مایع نمونه را به سمت پایین لوله انتقال می‌دهد ولی چون فاز جامد ترکیبات مختلف موجود در نمونه را با قدرت یکسانی جذب نمی‌کند،برخی ترکیبات سریع‌تر داخل ستون حرکت می‌کنند.

فاز جامد این نوع کروماتوگرافی از جنس موادی همچون آلومین،سیلیکاژل،فلورسین،منیزیم اکسید،کربنات کلیسم و…می باشد.

در سال ۱۹۷۸ کلارک استیل نسخه‌ی جدیدی از کروماتوگرافی ستونی را تحت عنوان کروماتوگرافی ستونی فلش اختراع کرد.در این تکنیک،حلال تحت تاثیر یک فشار اضافی خارجی درون ستون حرکت می‌کند؛این حالت سبب می‌شود مدت زمان کروماتوگرافی کاهش یافته و در حدود ۲۰ دقیقه،جداسازی اجزا انجام شود.

  • مسطح

کروماتوگرافی کاغذی: در این تکنیک محلول روی نقطه ای از کاغذ کروماتوگرافی گذاشته می‌شود.کاغذ درون ظرف حاوی مایع حلال قرار می‌گیرد و سپس حلال از طریق کاغذ،بالا می‌آید.کاغذ کروماتوگرافی از جنس سلولز و قطبیست و ترکیبات موجود در نمونه هرچه قطبیت کمتری داشته باشند بالاتر می‌روند.ترکیبات قطبی‌تر سریعتر با کاغذ تشکیل پیوند می‌دهند و در نتیجه مسافت زیادی را طی نمی‌کنند.

کروماتوگرافی لایه نازک:این روش از نوع کروماتوگرافی جامد-مایع است.در این نوع کروماتوگرافی یک قطره از از نمونه روی لایه‌ی جاذب که روی سطح جسمی بی اثر مانند شیشه پخش شده،گذاشته می‌شود.سپس لایه‌ی جامد درون ظرفی حاوی مایع استخراج کننده قرار می‌گیرد.(سطح مایع پایین‌تر از لکه‌ی نمونه است.)حلال توسط لایه جاذب به آرامی به سمت بالا کشیده می‌شود و در نتیجه هر یک از اجزای نمونه بسته به ویژگی هایشان در محلی خاص از لایه تجمع پیدا می‌کنند و در نهایت بطورت لکه‌ دیده می‌شوند.فاز ساکنِ کروماتوگرافی لایه نازک معمولا از جنس سلولز، سیلیکاژل یا آلومین است.

شرح برخی از انواع کروماتوگرافی،بر اساس حالتِ فاز متحرک،بصورت زیر است:

کروماتوگرافی‌های گازی:

  • کروماتوگرافی گاز-جامد(GSC): اساس این تفکیک،جذب سطحی گاز روی سطح جامد است.
  • کروماتوگرافی گاز-مایع(GLC):کروماتوگرافی گازی معمولا داخل ستونی انجام می‌شود که ممکن است ستونِ packed یا ستون مویین  باشد.ستون‌های packed،ارزان‌تر بوده و استفاده از آنها راحت تر است.ستون های مویین هرچند گران‌ترند اما دارای وضوح بهتری بوده و برای ترکیبات پیچیده تر مورد استفاده قرار می‌گیرند.هر دو نوع ستون از مواد شیمیایی بی اثر و جاذب تشکیل شده اند.

کروماتوگرافی گازی بر تعادل تقسیم آنالیت بین یک فاز ساکن مایع (اغلب سیلیکون مایع) و یک فاز متحرک گازی(اغلب هلیوم) مبتنی‌ست.فاز ساکن داخل یک شیشه با قطر کوچک(ستون مویین) و یا یک ماتریکس جامد در یک لوله‌ی بزرگتر(packed) ریخته می‌شود.این تکنیک برای آنالیزهای شیمیایی پرکاربرد است.هرچند دمای بالای مورد استفاده در آن،باعث واسرشتگی مولکول‌های زیستی از قبیل پروتئین ها می‌شود،اما جهت استفاده در تحقیقات بیوشیمی،در پتروشیمی،نظارت و اصلاحات محیط زیستی و شیمی صنعتی مناسب است.

کروماتوگرافی‌های مایع:

  • کروماتوگرافی مایع-مایع: این تکنیک بطور کلی از لحاظ قطبیت به دو نوع تقسیم می‌شود.روش‌هایی که در آن‌ها فاز ساکن قطبی‌تر از فاز متحرک است کروماتوگرافی فاز مایع نرمال نامیده می‌شود و حالت عکس آن،کروماتوگرافی فاز مایع معکوس نام دارد.

 کروماتوگرافی‌های کاغذی و تقسیمی از این نوع کروماتوگرافی هستند.

کروماتوگرافی تقسیمی: در این تکنیک،اساس تقکیک قدرت انحلال پذیری اجزا در فاز ساکن است.اجزایی که با سرعت بیشتری حل می‌شوند، سریع‌تر در طول ستون حرکت خواهند کرد.این روش شبیه به کروماتوگرافی ستونی جذب سطحیست با این تفاوت که معمولا ظرف مورد استفاده در این تکنیک کوچکتر است و همچنین فاز مایع موجود در ستون نیز متفاوت است.

  • کروماتوگرافی مایع-جامد: به انواع جذب سطی،ژلی،تبادل یونی و لایه کاغذی تقسیم می‌شود.

کروماتوگرافی ژلی:در این تکنیک از یک ژل پایدار و بی اثر استفاده می‌شود که دارای تخلخل‌هایی با اندازه های متفاوت است.در نتیجه اجزای نمونه بر حسب جرم مولکولی،به ترتیب از ستون خارج می‌شوند؛اگر نمونه شامل مولکول‌هایی با انداز‌ه‌ی بسیار بزرگ باشد،اصلا وارد ژل نشده و در نتیجه تفکیک نمی‌شوند.همچنین اگر اجزای خیلی ریز در مخلوط موجود باشد،در ژل فرورفته و از هم جدا نخواهند شد.

بیشترین کاربرد این نوع الکتروفورز در تفکیک ماکرومولکول های زیستی همچون پروتئین،آنزیم،اسید نوکلئیک و پلی ساکاریدهاست.همچنین جهت جداسازی درشت مولکول های مصنوعی نیز بکار می‌رود.

ویستاژن   ویستا ژن vistagene

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی