Real time PCR و کاربردهای آن

سایت ویستاژن در این مطلب به بررسی Real time PCR پرداخته است.

Real time PCR چیست؟

برای مشاهده‌ روند دقیق تکثیر طی PCR، از سیستمی تحت عنوان real time PCR استفاده می‌شود. در این روش نیازی به استفاده از الکتروفورز نیست؛ همچنین میزان تکثیر در هر سیکل، با دقت حتی یک مولکول قابل ردیابیست.

به این تکنیک، Quantititave PCR یا به اختصار qPCR نیز می‌گویند.

کاربرد Real time PCR 

این تکنیک کاربرد گسترده و متنوعی در آزمایشگاه دارد. استفاده از آن هم در تشخیص و هم در تحقیقات پایه ای رایج است. کاربرد آن در صنعت شامل ایمنی مواد غذایی و فساد مواد غذایی و تخمیر، تشخیص ارگانیسم های اصلاح  یافته ژنتیکی و کمیت و ژنوتیپ پاتوژن های ویروسی انسانی می‌شود. Real time جهت تشخیص بیماری‌هایی که از روی نوکلئیک اسید مشخص می‌شوند، برای مثال بیماری های عفونی، سرطان و ناهنجاری های ژنتیکی بکار می‌رود. همچنین در آزمایشگاه های میکروبیولوژی ابزاری برای تشخیص بیماری های نوظهور همانند سویه های جدید آنفلوآنزا و ویروس کرونا است.

به طور کلی دو روش برای تشخیص محصولات در real time رایج است:

۱. افزودن رنگ فلوئورسنس SYBR Green به محیط واکنش؛ این رنگ به هر مولکول DNA که بصورت دو رشته ای باشد متصل می‌شود و نور فلوئورسنت از خود ساطع می‌کند. در نتیجه اختصاصی عمل نکرده و ممکن است در اثر اتصال به دایمر پرایمرها یا محصولات غیراختصاصی دیگر،سیگنال تولید کرده و گزارش دقیقی از مقدار محصولات مورد نظر ما بدست ندهد.

۲. افزودن توالی های گزارشگر هدف یا reporter probe؛ این شناساگرها که توالی TaqMan probes نیز خوانده می‌شوند، بصورت اختصاصی عمل کرده و دارای یک رنگ فلوئورسنت متصل به سر ‘۵ و یک بخش quencher (که مهارکننده‌ی رنگ است) متصل به انتهای دیگر خود هستند. توالی این اولیگونوکلئوتید به گونه‌ایست که دو سر آن با یکدیگر مکمل شده و در نتیجه‌ی هیبریدیزاسیون رشته، quencher و رنگ فلوئورسنت در مجاورت هم قرار می‌گیرند و در نتیجه سیگنالی ساطع نمی‌شود. حین انجام PCR، در نتیجه‌ی اثر اگزونوکلئازی ‘۵ به ‘۳ آنزیم Taq polymerase، اتصال بین رنگ فلوئورسنت و quencher شکسته شده و در نتیجه سیگنال آزاد می‌شود.میزان سیگنال های خروجی نشان دهنده‌ی مقدار محصول تولیدی در PCR است که توسط دستگاه خوانده شده و روی صفحه نمایشگر کامپیوتر نمایش داده می‌شود.

نمودار قابل مشاهده،تحت عنوان نمودار Amplification ،دارای سه مرحله می‌باشد:

  1. مرحله نمایی یا exponential phase که طی آن تکثیر با بازدهی بالا صورت می‌گیرد و در هر چرخه مقدار ماده ژنتیکی دو برابر می‌شود، در نتیجه سیگنال‌های قوی از دستگاه دریافت شده و نمودار به شکل نمایی صعود می‌کند.
  2.  مرحله خطی یا liner phase که بعلت مصرف شدن مقداری از اجزای واکنش، سرعت تکثیر کاهش پیدا می‌کند و شیب نمودار کمتر است.
  3. مرحله پلاتو یا plateau phase که آنزیم پلیمراز ضعیف یا تخریب شده، مواد واکنش تمام شده و در نتیجه تکثیر توقف کرده و نمودار شکل افقی به خود می‌گیرد.

RT-PCR چیست؟

RT-Real time PCR برای بررسی بیان یک ژن، نیاز است تا مقدار mRNA موجود در سلول اندازه گیری شود، زیرا مقدار mRNA ساخته شده از روی هر ژن، ارتباط مستقیم با میزان بیان آن ژن است. از آنجا که اساس کار PCR تکثیر DNA است، جهت بررسی بیان ژن لازم است mRNA های مربوط به آن ژن را از سلول استخراج کرده و سپس با reverse transcription، DNA مکمل آن را ایجاد کنیم. این DNA ها که cDNA نامیده می شوند، می‌توانند تحت فرایند PCR قرار بگیرند. به این روش، reverse transcription polymerase chain reaction یا به اختصار RT-PCR گفته می‌شود. در واقع RT-PCR نوعی از real time است که نمونه اولیه آن به جای RNA،DNA است.

 

 

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی

 

/12 دیدگاه /توسط

کشت بافت چیست؟

,

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش کشت بافت پرداخته است.

کشت بافت 

کاربرد روش های کشت آزمایشگاهی دانشمندان را قادر ساخته که سلول ها و بافت ها و یا اندام ها را از ارگانیسم مادری جدا کنند و آن ها را به عنوان واحدهای زیستی ایزوله شده در تحقیقات بعدی مورد بررسی قرار دهند. یک سلول ، برای اینکه بتواند در محیط کشت سلولی استفاده شود باید دارای قدرت تقسیم خود به خود باشد و این مورد امکان پذیر نیست مگر اینکه منبع کامل و دست نخورده کروموزومی داشته باشند در غیر این صورت نیاز به تحریک محیطی می‌باشد.

  • شرایط محیطی مناسب برای کشت دادن 

          1. استریل بودن محیط کشت 

اکثر میکروارگانیسم ها خیلی سریع تر از سلول های مورد نظر در محیط کشت رشد می‌کنند و در طی رشد خود نیز باعث تولید مواد سمی می شوند.

          2. لوله‌های کشت و سوبستراها 

      اثبات شده است که سلول های روی یک سطح با بار منفی به بهترین نحو ممکن رشد می‌کنند.

        3. محیط کشت و مواد افزودنی

هر محیط کشت ، نیاز به یک محلول نمکی نرمال دارد که برای کشت طولانی مدت ، مواد خاص پایدار دیگر افزوده شود.

        4.  مقدار PH محیط کشت 

میزان PH به محیط گازی کشت بستگی دارد .

       5.  درجه حرارت 

هر چه دمای محیط کشت بالاتر باشد، میزان رشد نیز بیشتر است تا اینکه به یک دمایی برسد که از آن دما بالاتر موجب انهدام سلولی شود.

      6. گازهای محیط کشت 

مرتبط با ترکیب های گازی مخصوصا دی اکسید کربن و اکسیژن می باشد.

 

 

کشت بافت

 انواع کشت بافت

  • کشت آمنیوسنتز (مایو آمنیونی) 

این نوع کشت در هفته‌های چهاردهم حاملگی و بعد از آن صورت می‌گیرد. مقدار حجم متناسب برای کشت سلولی 20 میلی لیتر می‌باشد. به طوری که دو مقدار مساوی 10 میلی‌لیتری از آن را برای بالا بردن درصد اطمینان در محیط های مختلف قرار می گیرد.
نمونه‌های بدست آمده را به دو قسمت تقسیم کرده بعد سانتریفوژ می‌نمایند. مایع آمنیونی تا 24 الی 48 ساعت بعد از نمونه برداری قابل کشت می‌باشد (در صورتی است که نمونه در یخچال نگهداری شود).

  • کشتهای بافت توده‌ای 

      1.پوست

از فرد بیمار ، پوستی به ضخامت 1 میلی متر و به قطر 4 میلی متر گرفته می شود، سپس چربی پوست را برطرف نموده و در محیط شستشو بلافاصله شسته می شود و یک شب در آن غوطه‌ور می‌کنند. نمونه‌های بزرگ تر معمولا از اجساد بدست می‌آید.

      2. جنین مرده

نمونه برداری از جنین و یا اینکه از کیسه جنینی انجام می‌گیرد.

     3. نمونه‌های ویلی کوریونی (CVS): در این روش باید دقت کرد که آلودگی سلول مادری در محیط کشت ایجاد نشود.

      4.محصولات حاملگی

این مورد برای مواد تخلیه شده از رحم بعد از پایان حاملگی اولیه و یا مواد حاصل از سقط خود به خودی بعد از سقط اولیه مورد استفاده قرار می گیرد .

  • کشت لنفوسیت 

گزارش اولیه در مورد تقسیم لکوسیت های خون محیطی در آزمایشگاه به سال 1915 برمی‌گردد.راحت‌ترین بافت قابل دسترسی خون محیطی می‌باشد که برای بررسی های کروموزومی در تشخیص سندروم های مختلف مورد استفاده قرار می گیرد و حتی این نوع محیط کشت ، به طراحی نقشه ژنی انسان نیز کمک شایان و قاب توجهی کرده است.

  • کشت سلول های هیبرید شده 

سلول ها در صورتی که همراه با ویروس کشته شده ،یا پلی اتیلن گلیکول کشت شوند باهم آمیزش می کنند، مانند هیبرید سلول انسان و سلول موش.
بخشی از سلول های ادغام شده، تا مرحله آمیزش هسته پیش می‌روند و قسمتی تا مرحله تقسیم سلولی هم پیشرفت می‌کند. به این صورت که هر دو سری از کروموزوم ها باهم تکثیر می شوند و سبب ایجاد یک آمیخته می شوند.
در برخی از این آمیخته‌ها ، یک سری از کروموزوم ها رفته رفته از بین می‌روند، مثل: کروموزومهای انسان. اما تعدادی از این کروموزوم ها باقی می‌مانند، که برای باقی ماندن مجبور به نوترکیبی با سری کروموزومی اند که باقی می‌ماند. چون درصد سلولهای آمیخته (هیبرید شده) زنده بسیار کم خواهد بود بنابراین به محیط ها کشت انتخابی نیاز است که شرایط زیست و زندگی را برای سلولهای آمیخته فراهم کند.

  • کشت سلول های ویژه مثل سلول های توموری

کشت سلول های توموری مثل کشت سلول های برخی بافت های اختصاصی بدن با اشکالاتی مواجه خواهد بود. ایجاد یک محیط کشت انتخابی برای سلول های توموری ، چندان پیشرفت نکرده است چرا که علی رغم رشد سریع توموری در موجود زنده ، این سلول ها در محیط آزمایشگاهی چندان رشد نمی‌کنند که این به دلیل استقلال سلول های توموری و عدم کنترل تکثیر آنها می‌باشد. اما با این وجود، توانسته اند با ایجاد شرایط تقریبا مساعد غذایی و هورمونی، ادامه حیات سلولهای توموری را در حد مطلوب یا در حد نگهداری قسمتی از سلول های کشت شده ممکن سازند.

 

●کاربرد کشت بافت 
  1. _بررسی فعالیت های درون سلولی مانند حرکت RNA از هسته به سمت سیتوپلاسم
  2. بررسی فعالیت بین سلولی مانند ساخت پروتئی
  3. بوم شناسی یا اکولوژی سلول های خاص (روابط موجود زنده با محیط) همچون دگرگونی در اثر عوامل بیماری زا
  4. تهیه واکسن های ویروسی
  5. بررسی موارد مربوط به خود سلول مانند : چگونگی چسبندگی به سلول های دیگر
  6. تشخیص سرطان ها
  7. بررسی واکنش های ایمنی مثلا با تولید پروتئین های مونوکلونال
  8. آنالیز ژنتیکی

گردآورنده: جناب آقای حسن مسرور

ویستاژن vistagene vista gene

/10 دیدگاه /توسط

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز

,

سایت ویستاژن در این مقاله به توضیح روش PCR پرداخته است.

PCR چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase chain reaction) یا PCR، در زیست شناسی مولکولی برای ایجاد تعداد زیادی رونوشت از توالی های کوتاه DNA  یا ژن بکار می‌رود که ابزاری رایج در پزشکی و تحقیقات زیست‌شناسی است. با استفاده از این روش می‌توان هزاران یا میلیون ها نسخه کپی از قسمت خاصی از DNA را از مقدار کمی DNA بدست آورد.

این تکنیک در سال ۱۹۸۳ توسط یک بیوشیمیست آمریکایی به نام Kary Mullis اختراع شد که در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را برای این اختراع خود دریافت کرد.

اساس کار PCR، شامل فرآیند گرم کردن و سرد کردن است که زنجیره های دمایی نامیده شده و توسط دستگاه مربوطه فراهم می‌شود. فرآیند PCR ممکن است چند ساعت به طول بیانجامد و یا با استفاده از دستگاه‌های خاص با سرعت بالا، در کمتر از یک ساعت انجام شود. این چرخه های دمایی ابتدا بصورت دستی کنترل می‌شدند و همچنین از آنزیم پلیمرازی استفاده می شد که نسبت به دما حساس بود و در هر چرخه دمایی denature می‌شد؛ در نتیجه لازم بود در هر چرخه، دوباره آنزیم پلیمراز به محیط  اضافه شود. Mullis در سال ۱۹۸۵ آنزیم Taq DNA polymerase را از باکتری حرارت دوست Thermus aquaticus استخراج و در آزمایش بکار برد تا در طول انجام PCR پایدار بوده و نیاز به اضافه کردن مجدد آنزیم در هر چرخه دمایی نباشد. همچنین در سال ۱۹۸۷ اولین ماشین PCR که PCR   1000 Thermal Cycler نام داشت توسط Cetus و Perkin-Elmer ساخته و به آزمایشگاه ها عرضه شد تا چرخه های دمایی را بطور اتوماتیک تکرار کند.

 مواد لازم PCR 

  1. DNA اولیه ای که قصد تکثیر آن را داریم.
  2. پرایمر ها (آغازگرها)
  3. نوکلئوتیدها؛ که به آن ها  dNTP گفته می‌شود و واحدهای ساختاری DNA هستند.
  4. آنزیم Taq polymerase (برای اضافه کردن نوکلئوتید ها به زنجیره DNA)
  5. بافر که برای ایجاد شرایط مناسب واکنش بکار می‌رود.

مراحل PCR 

۱.مرحله‌ی واسرشته شدن یا  denaturing phase 

مرحله ای که در آن، در نتیجه‌ی بالا رفتن دمای واکنش تا حدود ۹۴ درجه‌ی سانتیگراد، با شکستن پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازها،دو رشته DNA از هم جدا شده و از یک مولکول DNA، دو تک رشته DNA حاصل می‌شود که هر کدام از این رشته ها بعنوان رشته‌ی الگو برای ساخت DNA جدید عمل می‌کنند.این مرحله بین ۱۵ تا ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.

۲.مرحله‌ی اتصال یا annealing phase 

در این فازدما تا حدود ۵۰-۶۵ درجه (بسته به دمای اتصال پرایمرها) کاهش می‌یابد تا پرایمرها به ناحیه مکمل خود در DNA متصل می‌شوند. (یکی از پرایمرها به سر ‘۵ یک رشته‌ی DNA و دیگری به سر ‘۳ رشته‌ی دیگر متصل می‌شوند). مرحله‌ی اتصال حدود ۱۰ تا ۳۰ ثانیه طول می‌کشد.

۳.مرحله‌ی گسترش یا extension phase 

افزایش مجدد دما، تا حدود ۷۲ درجه سانتیگراد، سبب فراهم آمدن دمای مطلوب برای فعالیت آنزیم DNA polymerase  Taq شده و آنزیم می‌تواند در چنین شرایطی dNTP ها را به پرایمر اولیه اضافه کرده و به تدریج رشته‌ی جدید را طویل سازد. این آنزیم از باکتری گرمادوستی به نام  Thermus aquaticus گرفته شده که در دماهای بالا قادر به ادامه‌ی حیات است. بنا براین آنزیم در دمای بالایی که طی فاز denaturing با آن مواجه است تخریب نمی‌شود. مدت زمان این مرحله به طول DNA بستگی دارد ولی رونویسی هر هزار نوکلئوتید بطور متوسط حدود ۱ دقیقه زمان می برد.

این سه مرحله حدود ۲۰ تا ۴۰ بار در طول PCR تکرار می‌شوند و هربار مقدار DNA موجود، به دوبرابر افزایش می‌یابد.

پس از این که تکثیر انجام شد با استفاده از تکنیک الکتروفورز، کیفیت و اندازه‌ی DNA های ساخته شده قابل بررسی است.

 

اگر به این مبحث علاقه مندید، مقاله« Real time PCR و کاربردهای آن» را مطالعه بفرمایید.

 

گردآورنده : سرکار خانم لیلا تنهایی

vistagene vistagene ویستاژن

/0 دیدگاه /توسط

کاربرد های کلونینگ در پزشکی

,

کاربردهای کلونینگ در پزشکی

یکی از مهم ترین فواید انقلاب DNA نوترکیب، جنبه های بالینی آن بوده و خواهد بود. در این مقاله سایت ویستاژن به بررسی این کاربردها پرداخته است.

  1. تولید داروهای نوترکیب

  • انسولین نوترکیب
  • سنتز هورمون رشد انسانی در E.coli
  • فاکتور VIII نوترکیب
  • ساخت دیگر پروتئین های انسانی نوترکیب
  • واکسن های نوترکیبپ

2. تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

3. ژن درمانی

تولید داروهای نوترکیب

برخی از بیماری های انسان به دلیل فقدان پروتئین ها یا عملکرد نامناسب آن ها در بدن بوجود می آیند. بسیاری از این بیماری ها ر می توان با تجویز پروتئین مناسب درمان کرد. اما برای این کار در مرحله اول پروتئین مورد نظر باید در مقادیر بالا وجود داشته باشد. اگر پروتئین مورد نظر انسانی باشد،بدست آوردن مقادیر مناسب مشکل بزرگی محسوب می شود مگر اینکه بتوان آن را از خون استخراج کرد.

پروتئین های حیوانی اگر کارایی لازم را برای درمان بیماری های انسانی داشته باشند،مورد استفاده قرار می گیرند.اما بیماری هایی که قابل درمان با پروتئین های حیوانی باشند،زیاد نیستند و در اغلب موارد احتمال پیدایش عوارضی مثل پاسخ های حساسیتی وجود دارد.

 تشخیص ژن های مسئول بیماری های انسان

دومین زمینه اصلی کاربرد کلون سازی ژن ها در تحقیقات پزشکی،شناسایی و جداسازی ژن های مسئول بیماری های انسانی است.

یک بیماری ژنتیکی یا ارثی بیماری است که در اثر نقص یک ژن خاص ایجاد می شود.افرادی که حامل ژن معیوب هستند در مرحله ای از طول حیات خود بیماری را تجربه می کنند. در مورد برخی از بیماری های ارثی مثل هموفیلی، ژن روی کروموزوم X قرار داد، بنابراین تمام مردانی که ژن معیوب دارند،بیماری را بروز می دهند و زنانی که یک ژن معیوب و یک سالم دارند، سالم خواهند ماند.اما ممکن است بیماری را به پسران خود انتقال دهند.

ژن های بیماری های دیگر روی کروموزوم اتوزومی قرار دارند و در بیشتر موارد مغلوب هستند، بنابراین وجود نقص در هر کروموزوم، لازمه بروز بیماری است. تعداد کمی از بیماری ها مثل هانتینگتون، با وجودی که اتوزومی هستند، غالب می باشند و حتی وجود یک نسخه از ژن معیوب برای ایجاد بیماری کافی است.

اهمیت شناسایی ژن مسئول در بروز بیماری های ژنتیکی

  • با شناسی ژن ممکن است اساس بیوشیمیایی بیماری حاصل شود و به این ترتیب امکان طراحی روش درمان پدید آید.
  • از شناسایی جهش های موجود در ژن معیوب می توان برای انجام برنامه های غربالگری استفاده کرد و به این ترتیب افراد حامل یا کسانی که هنوز بیماری در آنها پیشرفت نکرده است را شناسایی کرد.
  • شناسایی ژن، یک پیش نیاز برای ژن درمانی است.

ژن درمانی

ژن درمانی به روشی اطلاق می شود که هدف آن درمان یک بیماری ارثی با انتقال نسخه صحیحی از ژن معیوب به فرد بیمار است. ژن درمانی در حال حاضر گسترش زیادی پیدا کرده است و  شامل تلاش هایی است که برای درمان بیماری، یک ژن کلون شده را به بیمار وارد می کنند.

مقاله «کلونینگ و پروتکل انجام آن»  را مطالعه بفرمایید.

 

رفرنس:کتاب کلون سازی ژن ها نوشته پروفسور براون

vistagene  vistagene   vistagene    vistagene کلویننگ 

/8 دیدگاه /توسط

کلونینگ و پروتکل انجام آن

, ,

سایت ویساژن در این مقاله به توضیح روش کلونینگ پرداخته است.اگر به این موضوع علاقه مندید می توانید مقاله «کاربرد های کلونینگ در پزشکی» را نیز مطالعه بفرمایید.

کلونینگ چیست؟

کلونینگ به تولید کپی های یکسان از ارگانیسم ها، سلول ها یا توالی های نوکلئویک اسید می گویند. این فرایند با دستکاری و تداخل انسان صورت می پذیرد.

نکته: توالی های  DNA انسانی که در طی رشد طبیعی تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب نمی شوند ولی توالی هایی که به وسیله ی  PCR  تکثیر پیدا می کنند کلون محسوب می شوند.

مراحل کلونینگ  Gene cloning

1 – جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از بقیه قطعات DNA

2 – گزینش وکتور مناسب

3 – اینتگره و متصل کردن ژن با وکتور و ایجاد پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – منتقل کردن پلاسمید به میزبان  ( Transformation or Translection)

5 – تکثیر و زیاد کردن پلاسمید (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 – انجام رونویسی (Transcription  )

7 – ترجمه و ساخت  پروتئین (Translation )

 آموزش کلونینگ 

برای کلون کردن محصول PCR که درون وکتور مناسب قرار گرفته است، به همراه وکتور با استفاده از آنزیم های محدودگر یکسان برش داده می شود و با یکدیگر مخلوط می گردند و توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل می شوند. در مرحله بعد این مولکول DNA نوترکیب طی روندی به نام ترانسفورماسیون به درون سلول میزبان انتقال می یابد.

جداسازی محصول PCR

در ژل آگارز قطعات DNA بر اساس وزن از هم جدا می شوند. در نتیجه باند محصول PCR از ژل جدا و خالص می شود.

مواد مورد استفاده

  • ایزوپروپانل
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer

روش کار جداسازی ژن

  • باند مورد نظر توسط اسکالپل از ژل جدا می شود. بهتر است تا حد ممکن کمترین میزان ژل به همراه باند جدا شود.
  • سپس 300 میکرو لیتر Binding Buffer  به آن اضافه می شود.
  • ژل آگارز به همراه بافر برای مدت 10 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد قرار می گیرد تا ژل به خوبی حل شود.
  • 150 میکرولیتر ایزوپروپانول به آن اضافه می شود.
  • نمونه به خوبی ورتکس شده، کل نمونه به یک Filter tube که درون یک Collection tube  قرار دارد منتقل می شود. و در 13200 rpm  برای یک دقیقه سانتریوفیوژ می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 500 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • مایع زیری دور ریخته شده و فیلتر با 200 µl محلول Binding buffer  شستشو داده می شود.
  • Filter tube درون یک تیوپ اپندروف استریل قرار گرفته و µl 50 محلول Elution   به آن اضافه می شود. پس از سانتریوفوژ نمونه در 13200 rpm  برای مدت 1 دقیقه  درون تیوپ انتقال می یابد.
  • برای ارزیابی کیفیت و غلظت DNA تخلیص شده 5 µl از نمونه در ژل آگارز 1 درصد ران می شود.

لایگیشن

  • لایگیشن مقدمه ای برای مرحله بعد یعنی ترانسفورماسیون می باشد جهت تکثیر قطعه هدف به مقدار زیاد، این قطعه باید در وکتور مناسب وارد شده و سپس همراه با وکتور وارد یک سلول میزبان شود.
  • آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین دو نوکلئوتید مجاور می شود. از نکات بسیار مهم در این واکنش غلظت نمونه DNA  هدف می باشد که برای موفقیت واکنش بسیار مهم است.

مواد مورد استفاده در کلونینگ 

  • پلاسمید  3 µl
  • DNA تخلیص شده 16 µl
  • Ligation buffer 3 µl
  • آنزیم 1 µl
  • PEG 3 µl
  • آب مقطر 1 µl

روش کار کلونینگ

  • در یک تیوپ اپندروف cc5 مواد زیر با یکدیگر مخلوط شده و سپس برای مدت یک شب در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

تهیه سلول مستعد 

  • جهت انجام ترانسفورماسیون سلول مستعد ورد نیاز است که پلاسمید نوترکیب به درون آن انتقال یابد.

مواد مورد استفاده 

  • باکتری
  • محلول CaCl2
  • محلول CaCl2-MgCl2
  • DMSO
  • محیط کشت

روش کار ترانسفورماسیون

  • ابتدا باکتری را در محیط  کشت داده و در انکوباتور 37 ساعت انکوبه می شود.
  • یک کلونی از باکتری را در 100 میلی لیتر محیط مایع کشت داده و در شیکرانکوباتور انکوبه کرده و پس از رسیدن به فاز لگاریتمی رشد انکوباسیون متوقف گردید.
  • محیط کشت به لوله 50 میلی لیتری انتقال می یابد( این لوله قبلا درون یخ قرار گرفته) و برای مدت 10 دقیقه درون یخ قرار می گیرد.
  • سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجهء سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

محیط روی سلول ها خارج و به رسوب حاصل , 30 میلی لیتر محلول CaCl2-MgCl2 سرد استریل اضافه شد.

سلول ها به مدت 10 دقیقه با دور 3000rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریوفوژ شد.

به رسوب باکتری 2 میلی لیتر محلول صفر درجه CaCl2 اضافه شد و سوسپانسیون سلولی تهیه شد.

به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد و به آرامی مخلوط گشت. و سپس به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد.

مجددا به ازاء هر 4 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی, 140 میکرولیتر DMSO به آن اضافه و سلول ها تقسیم و در 70- درجهء سانتیگراد نگهداری شد.

ترانسفورماسیون

  • با استفاده از روش شوک حرارتی در لحظات کوتاهی منافذی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان ایجاد کرده تا DNA نوترکیب وارد سلول شود. DNA حاصل از مرحله لایگیشن  جهت ترانسفورماسیون در سلول های مستعد مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین 100 µg/ml
  • IPTG
  • X-Gal
  • محصول لایگیشن ( پلاسمید نوترکیب)
  • سلول مستعد

روش کار

  • سلول های مستعد از دمای 70- درجه سانتیگراد خارج و در مجاورت یخ قرار داده می شوند تا به آرامی ذوب شوند.
  • تیوپ های اپندروف قبل از استفاده در یخ قرار می گیرند و سپس 20 میکرولیتر از سلول های مستعد به آنها اضافه شد.
  • 1 میکرولیتر از محصول لایگیشن به آرامی با سلول ها مخلوط و به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه شد.
  • تیوپ های اپندروف حاوی سلول و پلاسمید جهت شوک حرارتی , به مدت 30 ثانیه در دمای 42 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • تیوپ های اپندروف برای مدت 2 دقیقه در یخ قرار داده شد.
  • 80 میکرولیتر محیط کشت مایع بدون آنتی بیوتیک به آن اضافه و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
  • سپس این باکتری ها روی پلیت های حاوی آمپی سیلن( 100, X-Gal و IPTG کشت داده شد و در دمای 37 درجهء سانتیگراد قرار گرفت.
  • در ترانسفورماسیون سلول ها , استفاده از کنترل جهت ارزیابی کارایی ترانسفورماسیون و سلول ها و ممانعت از آلودگی , ضروری است

غربالگری

  • برای غربال نمودن کلنی های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده از آنتی بیوتیکی که ژن مقاومت به آن توسط وکتور نوترکیب حمل می گردد استفاده می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط کشت
  • آمپی سیلین
  • IPTG
  • X-Gal
  • پلیت های حاوی باکتری ترانسفورم شده

روش کار

  • ابتدا پلیت حاوی محیط کشت را به مدت 20 دقیقه زیر هود قرار داده تا به دمای محیط برسد. ( به این محیط کشت قبلا آمپی سیلین اضافه شده است) .
  • 40 میکرولیتر IPTG و 40 میکرولیتر X-Gal به سطح محیط کشت اضافه کرده و با غلطک شیشه ای پخش می شود و کمی فرصت داده می شود تا این مواد جذب محیط کشت شود.
  • با یک لوپ استریل از کلنی های سفید که به صورت تک می باشد برداشته و روی پلیت جدید کشت داده می شود. این کار برای اطمینان یافتن از صحت ترانسفورماسیون در کلنی های مورد نظر می باشد.
  • سپس پلیت ها به مدت یک شبانه روز در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند.
  • IPTG شناسایی پروموتور ویژه ژن Lac Z در فرادست ناحیه 5´ ژن و القاء رونویسی آن و تولید آنزیم بتا گالاکتوزیداز را بر عهده دارد. سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و آنزیم بتا گالاکتوزیداز را تولید کنند حاوی وکتور نرمال می باشند. اما سلول هایی که در حضور آمپی سیلین رشد کرده و به دلیل وارد شدن قطعه DNA هدف این ژن قادر نباشند آنزیم فوق را تولید کنند حاوی وکتور نوترکیب می باشند.
  • X-GaL به عنوان سوبسترا برای بتا گالاکتوزیداز محسوب شده و بعد از تجزیه توسط این آنزیم ماده ای به رنگ آبی تیره در اطراف سلول های حاوی ژن فعال بر جای می ماند. وکتور نوترکیب به دلیل عدم آنزیم فوق نمی تواند X-Gal را تجزیه نماید در نتیجه کلنی های تشکیل شده سفید می باشند.

استخراج پلاسمید

روش لیز قلیایی به همراه دترجنت SDS بیش از 20 سال است که برای جداسازی پلاسمید از باکتری E.Coli  مورد استفاده قرار می گیرد. اگر سوسپانسیون باکتریایی با دترجنت های غیر یونی قوی در  pH بالا مجاور شود. دیواره باکتری تخریب کروموزوم و پروتئین های باکتریایی دناتوره و پلاسمید در محیط آزاد می شود.

مواد مورد استفاده

  • محیط LB Broth حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین
  • Suspension Buffer
  • RNase A
  • Lysis Buffer
  • Binding Buffer
  • Wash Buffer
  • Elution Buffer
  • High pure filter tubes
  • Collection tube

روش کار

  • باکتری در محیط حاوی آمپی سیلین کشت داده می شود تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر به 5/1 تا 5 برسد.
  • 4-5/0 میلی لیتر از محیط سانتریوفوژ می شود تا سلول ها جدا شوند.
  • سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از محلول susprnsion buffer RNase تهیه می شود.
  • 250 میکرولیتر Lysis Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود.
  • 350 میکرولیتر Binding Buffer به آن اضافه می شود و به آهستگی مخلوط می شود.
  • نمونه به مدت 5 دقیقه در روی یخ انکوبه می شود
  • نمونه به مدت 10 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • محلول رویی به درون یک فیلتر تیوپ منتقل شده و 30 ثانیه تا 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • فیلتر توسط 700 میکرولیتر Wash Buffer شسته و فیلتر تیوپ به مدت 1 دقیقه با حداکثر دور سانتریوفوژ می شود.
  • مایع تجمع یافته خارج شده , و 50 میکرولیتر Elution Buffer  یا   آب به آن اضافه می شود.
  • نمونه به مدت 1 دقیقه در 13200 rpm ساتریوفوژ شده و محصول انتهایی DNA پلاسمیدی تخلیص شده می باشد.

 

vistagene   vistagene   vistsgene   vistagene  vistagene   ویستاژن ویستاژن ویستا ژن  ویستا ژن  ویستا ژن

استفاده از مطالب سایت ویستاژن تنها با ذکر نام و لینک سایت و با هماهنگی با مدیریت  امکان پذیر می باشد.

/6 دیدگاه /توسط