استخراج DNA از باکتری و پروتکل انجام آن

,

سایت ویستاژن به توضیح روش استخراج DNA از باکتری و پروتکل آن پرداخته است.

به طور کلی باکتری ها به  دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می شوند. این تقسیم بندی به دلیل تفاوت در ساختار دیواره سلولی و نوع رنگ پذیری آنها صورت گرفته است. باکتری های گرم مثبت دارای لایه ضخیمی از پپتید و گلیکان در دیواره سلولی خود هستند ولی باکتری های گرم منفی لایه نازکی از پپتید و گلیکان در دیواره سلولی خود دارند لذا مقاومت کمتری نسبت به گرم مثبت ها دارند.

بررسی ژنتیکی باکتری ها نشان داده آنها هاپلوید بوده و تنها یک نسخه DNA حلقوی دارند.

اصول استخراج DNA در تمام سویه ها یکسان است که شامل تخریب غشا، رسوب مرحله ای ناخالصی ها و نهایتا استخراج DNA خالص است.

دو روش برای استخراج DNA وجود دارد

  1. روش فیزیکی: شامل استفاده از حرارت،انجماد، فشار اسمزی و …..
  2. روش شیمیایی: شامل استفاده از آنزیم ها، دترجنت ها و بافرهای خاص می باشد.
  3. در استخراج DNA از باکتری ها باید از روشی استفاده کنیم که کمترین آسیب به DNA که فاقد غشا هسته است وارد شود.

روش فیزیکی:

مزیت این روش ارزان تر بودن آن است و همچنین ریسک آسیب به DNA را نسبت به روش شیمیایی با استفاده از آنزیم ها کمتر می کند.

مواد و لوازم مورد نیاز

سوسپانسیون باکتریایی

بافرTBE

بافر TE

آّب

سانتریفیوژ

بن ماری

سمپلر

ویال

کاغذ صافی

روش انجام آزمایش

ابتدا به وسیله سمپلر 500 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری را در ویال ریخته و به مدت 5 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفیوژ می کنیم. رسوب بدست آمده حاوی باکتری های زنده است و فاز مایع رویی حاوی باکتری های مرده که دور ریخته می شود.

در مرحله بعد 300 میکرولیتر بافر TBE به رسوب موجود در ویال افزوده و به مدت 5 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ می شود. بافر TBE باعث تغییر PH در اطراف محیط DNA می شود و همین تغییر PH باعث فشرده تر شدن DNA می شود. این فشردگی DNA باعث می شود تا در اثر سانتریفیوژ آسیب نبیند. رسوب حاصل که بر اثر دریافت بافر سنگین و ته نشین شده را نگه می داریم و فاز مایع که حاوی باکتری های زنده فاقد بافر است را دور می ریزیم.

میزان 400 میکرولیر آب را در ویال ریخته و به مدت 20 دقیقه در بن ماری 80 درجه قرار می دهیم. استفاده از آب سبب پخش گرما به طور یکنواخت به تمام قسمت های ویال می شود.

سپس ویال را به مدت 3 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ میکنیم. رسوب حاویDNA  و RNA و پروتیین ها را نگه داشته و فاز مایع رویی حاوی غشا خارجی سیتوپلاسم  و اندامک ها را دور می ریزیم.

تا اینجا به دلیل استفاده زیاد از سانتریفیوژ و بن ماری غشا خارجی باکتری ها شکنده و ضعیف شده است و از طرفی برخورد باکتری ها به یکدیگر و فشار محتویات سیتوپلاسم به دیواره در طی سانتریفیوژ منجر به لیز دیواره و آزاد شدن DNA در محیط می شود. یعنی عملا از هیچگونه آنزیمی برای لیز دیواره استفاده نکردیم.

در مرحله آخر جهت تخلیص DNA و RNA و پروتیین ها، رسوب را به ویال فیلتردار منتقل می کنیم. ویال فیلتر دار دارای بار مثبت است و DNA چون بار منفی دارد، به ویال می چسبد و اتصالی قوی با آن پیدا میکند. برای لیز RNA و پروتیین های موجود در ویال فیلتر دار، می توان از آنزیم RNAase و پروتیاز استفاده کنیم. سپس با استفاده از بافر TE،می توان DNA تخلیص شده را به صورت سوسپانسیون درآورد و برای عمل PCR  و کارهای تحقیقاتی بعدی خفظ کرد.

7 پاسخ

دیدگاه خود را ثبت کنید

تمایل دارید در گفتگوها شرکت کنید؟
در گفتگو ها شرکت کنید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

پنج × یک =